核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒（ribonucleoprotein particle），主要由RNA和蛋白质构成，其唯yi功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链，所以核糖体是细胞内蛋白质合成的分子机器。核糖体无膜结构，主要由蛋白质（40%）和RNA（60%）构成。核糖体按沉降系数分为两类，一类（70S）存在于细菌等原核生物中，另一类（80S）存在于真核细胞的细胞质中。

RiboLace Mod. 1核糖体提取试剂盒是一款由Immaginabiotechnology公司基于嘌呤霉素（嘌呤霉素是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构,能够同氨基酸结合,代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合）通过无抗体、无融合标签蛋白的Pull-Down技术来分离活性核糖体的试剂盒。

 

 

操作使用

 

实验流程图

 

（1）实验前准备

另外需自备的材料

l 10% 脱氧胆酸钠（DNase/RNase free water）

l cycloheximide

l RiboLock RNase抑制剂

l SUPERase•In™ RNA酶抑制剂

l 无RNA酶和DEPC水

l 酸酚–氯仿混合液

l Nanodrop ND-1000 UV-VIS分光光度计

l 糖原蓝色染料

l 异丙醇

l 微型离心机和无RNA酶微量离心管（0.2 mL和1.5 mL）

l 旋转器

l 用于1.5mL试管的磁力支架

 

a. 稀释RiboLace smart probe：在RiboLace smart probe中加入316.5 μL B-Buffer，然后在冰上解冻。使用后，建议将混合物等分，并储存于-80℃，避免两次以上的反复冻融。

b. 在裂解缓冲液Lysis Buffer使用前添加以下成分：脱氧胆酸钠（1 %终浓度）、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制剂。

（2）裂解

贴壁细胞裂解

a.裂解前，使用10 µg/mL的环己酰亚胺（CHX）在37℃下处理细胞5 min。我们建议使用70-80 %汇合的细胞。CHX处理可提高核糖体亲和纯化的效率，可选步骤。如果您使用的是人体或小鼠组织，请注意裂解缓冲液和W-缓冲液中都含有CHX（10 ng/mL）。

b.孵育后，将细胞置于冰上，并用含有CHX（20 µg/mL）的冷PBS快速洗涤。

c.用移液枪去除PBS

d.将加入了脱氧胆酸钠（1 %终浓度）、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制剂的裂解液加入细胞培养皿中进行裂解，并用力刮擦（适当的机械刮擦对有效裂解很重要）。

e.在1.5 mL离心管中收集细胞裂解物，并在20000 g离心5 min。

f.将上清液转移到新的试管中，冰浴20 min。

g.使用Nanodrop分光光度计，取1 µL细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置Nanoddrop的“核酸”功能）

悬浮细胞裂解

a.裂解前，使用10 µg/mL的环己酰亚胺（CHX）在37℃下处理细胞5 min。我们建议使用70-80 %汇合的细胞。CHX处理可提高核糖体亲和纯化的效率，可选步骤。如果您使用的是人体或小鼠组织，请注意裂解缓冲液和W-缓冲液中都含有CHX（10 ng/mL）。

b.收集细胞，在4℃下以950 g离心5 min，弃培养基，用含有CHX的冷PBS（20 µg/mL）快速洗涤细胞。

c.收集并在4℃下以950 g离心5 min。除去上清液，并用加入了脱氧胆酸钠（1 %终浓度）、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制剂的裂解液将细胞重悬。

d.通过G26针（约10次）使细胞裂解而不产生气泡。

e.20000 g离心5 min。

f.将上清液转移到新的试管中，冰浴20 min。

g.使用Nanodrop分光光度计，取1 µL细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置Nanoddrop的“核酸”功能）

组织裂解

a. 用研钵和研杵在液氮下将纸巾碾碎。回收粉末于1.5 mL试管中

b. 每10 mg组织加入800 µL 组织裂解液 (IMMAGINA cat. nr. #RL001-2)，请注意裂解缓冲液和W-缓冲液中都含有CHX（10 ng/mL）。

c. 20000 g离心2 min并收集上清液。

d. 再次以20000 g离心上清液5 min，并收集上清液，冰浴20 min。

e. 使用Nanodrop分光光度计，取1 µL细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置Nanoddrop的“核酸”功能）

（3）磁珠处理

a. 从4°C下取出RiboLace磁珠，并将试管置于RT下至少30分钟。

b. 将RiboLace磁珠管涡旋30秒以上。

c. 加入90 µL RiboLace磁珠至新的1.5 mL试管中。最终体积=90 µL x N（N=样品数量），随后置于磁力架上，去除上清液。

d. 取下试管，用等体积（90 µL x N）的OH缓冲液洗涤RiboLace磁珠5分钟，然后弃掉上清液。

e. 向离心管中加入900 µL不含核酸酶的水洗涤磁珠。

f. 加入体积为（90 µL x N）的B-缓冲液洗涤珠子，3分钟，共两次。将试管放于磁力架上至少1分钟，然后弃上清液。

g. 加入（30 µL x N）体积的稀释的RiboLace smart probe，1400 RPM室温孵育1 h，注意不要让磁珠沉淀，在孵育期间，可以进行核酸酶处理的步骤。

h. 另取2 µL 已稀释的RiboLace smart probe保存于冰上，作为后续验证。

i. 孵育后，将试管放在磁力架上，留存3 µL上清液作为验证。

j. 向管中加入一定体积（3 µL x N）mPEG，在室温下在振荡器中混匀15 min。注意不要让磁珠沉淀。

k. 将试管置于磁力架上2-3 min，弃上清液，加入500 µL不含核酸酶的水洗涤。

l. 加入500 µL W缓冲液清洗磁珠，两次。

m. 加入200 µL的W缓冲液将RiboLace磁珠重新悬浮，并根据样品的（N）个数将结合的磁珠等分。注意不要让磁珠变干。

n. 结合效率的预估：将孵育后的上清液与未与磁珠孵育的RiboLace smart probe在270 nm（Nanodrop ND-1000）处的吸光度进行比较，可以估计磁珠结合效率（预计吸光度降低约10-50%）。

（4）核酸酶处理

a. 将W缓冲液加入总体积为0.1-0.3 A. U（260nm）的裂解液，至最终体积为150 µL。

b. 加入0.3 µL Stabilizing Nux Solution (SS)，吸打混匀。

c. 取2 mL管，加入1.5 µL核酸酶（Nux），并加入98.5 µL W缓冲液（WB）。用移液枪吸打5次，使稀释的Nux溶液充分混匀。

d. 加入稀释的核酸酶（Nux）溶液于1.5 mL离心管中，25°C处理样品45 min，核酸酶（Nux）溶液使用体积（µL）为A.U x 5。

e. 加入0.5 µLSUPERase•In™ RNA酶抑制剂，冰浴10 min。

（5）核糖体Pull-Down

仅在添加细胞裂解液之前，去除W缓冲液（步骤3.m中）

a. 向步骤3.m中处理过的磁珠中加入处理过的细胞裂解液并充分混合。

b. 4°C，慢速（3 rpm）孵育70分钟。

c. 取出离心管，不要离心，置于冰浴的磁力架上，保持在冰上操作，分离磁珠。

注意不要将磁珠从磁力架上取下，也不要触摸磁珠。

d. 500 µL W缓冲液小心清洗磁珠两次。

e. 从磁力架上取下，并用200 µL W缓冲液将磁珠重悬。

f. 将磁珠悬浮液转移至新的不含核酸酶的1.5 mL离心管中。

（6）核糖体分离

a. 向磁珠悬浮液中加入20 µL 10%SDS和5 µL蛋白酶K，并在37°C水浴75 min。

b. 加入225 µL酸性苯酚、氯仿、异戊醇混合物。

c. 涡旋混匀，14000 g离心5 min。

d. 如果离心后没有分离，可加入20 µL 2 M NaCl（DEPC水），再次离心。

e. 保留水相并将其转移至新的瓶中。

f. 加入500 µL异丙醇和2 µL糖源蓝色染料。

g. 混合并室温孵育3 min，然后在-80°C下储存：

至少2小时或过夜。

h. 4°C下离心（20000 g）30 min。

i. 加入5 µL无核酸酶水将RNA沉淀重悬。

j. 使用PAGExt试剂盒（Cat. No ##KGE002_12）进行RPFs PAGE纯化。

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常见问题

1. 在进行RiboLace Pull-Down之前，需要用环己酰亚胺处理细胞吗？

答：CHX（环己酰胺）存在于试剂盒中包含的裂解液（LB）以及W缓冲液（WB）中。RiboLace在使用或不使用环己酰亚胺的情况下都能很好地发挥作用。也就是说，细胞是否添加CHX处理取决于实验设置。一些客户在起始密码子周围发现了由于CHX引起的P位点周期性伪影。相反，CHX可以使核糖体保护片段的长度在28个核苷酸处向更均匀的峰值移动。根据我们的经验，20 µg/mL的CHX略微改善了P位点沿编码区的分辨率周期性。例如，从没有进行CHX处理的快速冷冻脑组织中获得了良好的P位点周期性。如果您的样品易流失核糖体，我们建议增加W缓冲液中的CHX浓度（目前为20 µg/mL，至40 µg/mL），并在每个W缓冲液中加入30 mL CHX储备溶液（10 mg/mL）。

 

2. 应该如何冷冻Ribolace实验的样品？

答：对于使用CHX裂解细胞，我们建议在进行RiboLace之前进行细胞裂解，并将其保存在-80的温度下，保存时间最多1-2个月。

对于不使用CHX裂解细胞，我们建议在进行RiboLace之前，快速冷冻并储存在-80℃下，最多1-2个月。

对于组织样品，我们建议在进行RiboLace之前，快速冷冻组织并将样品储存（-80℃）最多1-2个月。

 

3. 不能在一天内完成所有的步骤。处理过的磁珠可以储存并第二天继续吗？

答：是的，可以停止。我们建议将磁珠保持在含有RiboLace smart probe的溶液中，即在磁珠分离和加入mPEG之前。在室温1400 rpm孵育1 h后，可以将磁珠在4℃下储存过夜，不要冷冻。

 

4. RiboLace Mod. 1适用于哪些物种？

答：一般来说，RiboLace在真核细胞和组织上效果良好，截至目前，已在哺乳动物细胞、小鼠和昆虫组织中得到验证。

 

5. 试剂盒到货后有效期多久？

答：12个月

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