细胞内葡萄糖吸收检测试剂盒

 

 

 

◆原理

 

胰岛素是降血糖的激素，它能够以脂肪细胞或者骨骼肌等为中心促进糖输送活性，将糖从细胞外吸收到细胞内。

测定糖的吸收量一般是使用³H标记的3-O-甲基-D-葡萄糖和2-脱氧葡萄糖（2DG）的方法。这种方法需要用同位素，所以只能在RI管理区域内使用，在一般的实验室也无法使用。

本试剂盒使用安全，操作简单，用non-RI法能够简便地测定细胞内糖吸收量。

 

试剂盒测定

 

细胞吸收的2DG会在己糖激酶的催化下会被2-脱氧葡萄糖-6磷酸（DG6P）氧化，不继续进行酶反应而是留在细胞内。

本试剂盒是在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的酶反应下，生成2DG6P成比例地生成NADPH，然后NADPH发生氧化生成荧光基质后就可以测定荧光物质的荧光强度。

 

 

◆优点・特色

 

●　检测2-deoxyglucose (2DG) (葡萄糖类似物) 摄入的总量 

●　葡萄糖，2DG被细胞摄取后，在己糖激酶作用下，迅速磷酸化为2-脱氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P）。

●　而2DG6P在细胞内聚集，不会发生进行代谢。

●　细胞裂解物中的2DG6P在耦合酶作用下，产生荧光信号，其强度与2DG6P的量正相关。

●　利用已知2DG6P的标准曲线，对照检测的荧光强度计算样品2DG水平

 

相关产品比较

	【本试剂盒】 Measurement Kit, Broad Range, Fluorometric   Cat. No. MBR-PMG-K01E	【相关产品】 2-Deoxyglucose (2DG) Uptake Measurement Kit Cat. No. CSR-OKP-PMG-K01E
测定方法	Non-RI法	Non-RI法
操作时间	3小时	5~7小时（2天）
检测方法	荧光（Ex 540 nm/Em 590 nm）	发光（420 nm）
特征	测定范围广（0~50 μm）能够迅速进行测定 可以使用高通量法一步测定	高灵敏度（0~5 μm）定量检测试剂盒

 

 

◆案例・应用

 

试剂盒组成

 

试剂	规格	数量	储存（开封后）
2DG6P Solution (1 mM)	500 μL	3×3 mL	-20°C (避光)
Sample Diluent Buffer Concentrate (100x)	5 mL	1 vial
Substrate Buffer	9 mL	1 vial
Fluorescent Substrate	120 μL	1 vial
Enzyme Solution	270 μL	1 vial

该试剂盒可进行100次反应

 

需要准备：

●　超纯水（蒸馏水）

●　2-deoxyglucose 建议产品

●　牛血清白蛋白建议产品

●　96-well黑色多孔板 

●　96-well荧光酶标仪 （激发波长540 nm/荧光波长590 nm）

●　超声波细胞裂解装置

 

 

胰岛素刺激3T3-L1细胞分化后2DG的摄取情况

 

            

 

※具体操作见“相关资料”

 

胰岛素刺激3T3-L1细胞分化及样品制备

       对于您实验的细胞，需要根据细胞本身的情况优化培养基和各项条件，如实际浓度、培养时间及其他实验相关参数。
       以下是标准12孔培养板的3T3-L1细胞操作步骤。

试剂和培养基
･Serum-free culture medium
･Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) buffer at 37°C
(1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 1.3 mM CaCl2, 118 mM NaCl, 5 mM KCl, 30 mM Hepes, pH7.5)
･BSA (essentially fatty acid free and globulin free grade, use Sigma Ca. No. A0281 or equivalent)

･2-Deoxy-D-glucose (2DG) solution
･ Insulin solution
･ PBS(-)
･Phloretin or Cytochalasin B (or other glucose uptake inhibitor)

细胞样品制备

1) Differentiate 3T3-L1 cells to adipocytes in a 12-well culture plate.

2) Replace culture media with serum-free medium. Return to incubator for 6 hours.

3) Gently wash cells 3 times with 1.5 mL of warm KRPH buffer without BSA?.

4) Gently add 3 mL of warm KRPH buffer containing 2% BSA.

加入胰岛素

5) For this example, insulin is added to a final concentration of 1 μm .

6) Incubate cells for 18 min at 37°C.

加入2DG

7) For this example, 2DG is added to a final concentration of 1 mM.

8) Incubate cells at 37°C for 20 minutes.

9) Wash cells gently 3× with cooled PBS containing 200 μM Phloretin to inhibit further 2DG uptake.

细胞裂解及样品制备

10) Add 1.5 mL of 1× Sample Diluent Buffer.and lyse cells by sonication with a microtip sonicator.

11) Collect cell lysate to tube, and apply heat treatment at 80°C for 15 minutes.
　　　　Note: Do not add protease inhibitors to cell lysates.
　　　　Note: If an alternate method for cell lysis will be used, do not use NaOH as NaOH degrades 2DG6P.

12) Centrifuge lysates at 15000 x g for 20minutes at 4°C

13) Transfer cell lysate supernatants to a fresh tube. These cell lysate supernatants are your experimental samples.
　　　　Note: Supernatants can be stored at -20°C for later analysis.

检测细胞裂解液中的2 DG
 　　14) Follow the procedure of [Section III-1] “2DG Measurement Protocol” above.

【参考文献】

[1]	Yamamoto N, et al ,(2006). A nonradioisotope, enzymatic assay for 2-deoxyglucose uptake in L6 skeletal muscle cells cultured in a 96-well microplate. Anal. Biochem. 351: 139-145.