Cytoskeleton，Inc。很高兴为药物筛选，信号转导和细胞骨架研究提供广泛的试剂盒和产品。我们专注于生产纯化蛋白质和易于使用的试剂盒，以研究生物化学和细胞过程。我们的试剂盒可用于少量样品，用于基础研究或小屏幕（Biochem Kits™），也可用于大屏幕的高通量样品（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我们现有的产品，我们还在产品线中为微管，微管蛋白，运动蛋白，小G蛋白效应物，GAP，GEF和其他几种蛋白提供药物筛选服务。

Binding Proteins

结合蛋白质

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· 常见问题解答

肌动蛋白与细胞中的多种蛋白质相互作用
*，F-和G-肌动蛋白与细胞中的多种蛋白质相互作用（14）​​。目前有超过150种已知的肌动蛋白结合蛋白（ABP），其占细胞蛋白的约25％。ABP在肌动蛋白细胞骨架上赋予大量功能多样性，其涉及诸如肌肉收缩，唇形突破，细胞运动，胞质分裂和细胞质流动的过程。研究这些过程如何调节肌动蛋白丝功能和动力学是一个重要且不断增长的研究领域。

可以通过使用生物化学，遗传学和免疫学方法分离和研究肌动蛋白结合蛋白。因为存在超过50种类型的肌动蛋白结合蛋白，所以用于鉴定它们的方法及其功能/活性也是多种多样的。肌动蛋白亲和柱通常用于亲和纯化ABP，无论它们是F-或G-肌动蛋白结合。可以通过利用芘肌动蛋白荧光的聚合增强来进行显示潜在ABP影响肌动蛋白动力学的简单测定（参见测量肌动蛋白聚合物部分）。这种性质的研究有助于鉴定新的肌动蛋白结合蛋白。有几篇值得一读的关于识别和量化新肌动蛋白结合蛋白的可能方法的评论（15,16,17）

问题1：哪种肌动蛋白结合蛋白（ABP）可用作F-肌动蛋白结合对照？ 

答案1：肌动蛋白结合蛋白α-辅肌动蛋白（Cat。＃AT01）是一种F-肌动蛋白结合和交联蛋白，使其可用作F-肌动蛋白结合研究的对照。它的Kd是1μM，这意味着在该浓度下发生50％结合。因此，我们的目标是使用 2μM的α-肌动蛋白作为结合测定中的阳性对照。在结合反应中，2μM浓度的α-辅肌动蛋白相当于0.23μg/μl。此外，α-辅肌动蛋白对pH敏感，其高亲和力发生在pH 7.0。

问题2：Cytoskeleton的肌球蛋白或重的meromyosin是否具有F-肌动蛋白活力？ 

答案2：遗憾的是，我们不会出售运动级肌球蛋白或重肌红蛋白用于肌动蛋白运动试验。我们发现质量控制测试非常难以复制，因此我们无法充分确保试剂的质量。因此，肌球蛋白（Cat。＃MY02和MY03）和重型meromyosin蛋白（Cat。＃MH01）不推荐用于F-肌动蛋白运动测定。已经测试过这些试剂的客户在运动方面没有取得很好的成功，因此我们不建议购买样品进行测试。如果需要运动级肌动蛋白或重型meromyosin，我们建议遵循原始方案（Kron和Spudich，1985）并在液氮中冷冻100μl等分试样以确保稳定性。

    参考文献：  SJ Kron和JA Spudich，1985年。荧光肌动蛋白丝在固定在玻璃表面的肌球蛋白上移动。PNAS，83,6272-6276。

SiR-Actin Kit   SiR-肌动蛋白试剂盒

50 nmol SiR-Actin and 1 umol verapamil (Cat. # CY-SC001

SiR-肌动蛋白基于结合F-肌动蛋白的天然产物jasplakinolide。SiR-肌动蛋白是荧光的，细胞可渗透的并且对F-肌动蛋白具有高度特异性。Sir-actin在不需要遗传操作或过表达的情况下对内源性F-肌动蛋白进行染色。它在远红色中的发射使光毒性和样品自发荧光小化。SiR-肌动蛋白与GFP和/或m-cherry荧光蛋白相容。它可以使用标准的Cy5滤波器进行成像。SiR-肌动蛋白可用于活细胞和组织中的宽场，共焦，SIM或STED成像。探针数量允许50 – 200染色实验。*

光学特性

λ _腹肌    652纳米

λ _EM    674纳米
ε _大  1.0·10 ⁵  摩尔^-1 ·厘米^-1

*基于以下条件：0.5-1ml染色溶液/染色实验，0.5-1μM探针浓度。通过减少体积或探针浓度可以进一步增加染色实验的数量。

Q1。什么是STED显微镜以及它是如何工作的？

A1。STED显微镜代表受刺激的发射消耗显微镜。它是一种超分辨率显微镜，它可以捕获具有比传统光学显微镜更高分辨率的图像，传统光学显微镜受光的衍射约束。STED使用2个激光脉冲，一个是激发荧光团的激发脉冲，使其发荧光。被称为STED脉冲的第二脉冲通过在未被激发的中心焦斑周围的区域中的受激发射来去激发荧光团，从而继续发荧光。这是通过将STED脉冲聚焦成环形，即所谓的甜甜圈来实现的，其中中心焦点没有STED激光脉冲，赋予荧光区域高分辨率（图1;参见参考文献1了解更多信息）有关STED显微镜的详细信息）。

图1.人原代成纤维细胞中用SiR-微管蛋白标记的微管的STED显微图像。

Q2。为什么SiR肌动蛋白（或微管蛋白）探针适用于STED显微镜检查？

A2。STED显微镜提供了在体内研究纳米极谱规模的细胞细节的能力。为了利用这种超分辨率显微镜，人们必须能够以高特异性选择使用荧光探针检查的区域。此外，荧光探针必须是明亮的，光稳定的，没有或几乎没有光毒性，被激发并在远红光谱中发射。另外，如果探针用于活细胞成像（从而避免细胞固定时发生的固定伪影），则需要高细胞渗透性。SiR肌动蛋白和微管蛋白探针满足所有这些要求。简而言之，STED和SiR探针的组合允许亚细胞肌动蛋白和微管蛋白/微管结构的的荧光可视化及其在活细胞中的物理表征（参见图2）。2和参考 2）。 

图2.用SiR-肌动蛋白染色的培养的大鼠海马神经元的STED图像。底部图像是顶部图像的一部分的特写视图，以清楚地显示具有180nm周期性的肌动蛋白环（条纹）。感谢Elisa D'Este，MPI Biophysical Chemistry，Göttingen。

Q3。这些探头的滤波器组是什么？

A3。使用标准Cy5过滤器可视化SiR肌动蛋白和微管蛋白探针。宜激发为650nm，发射为670nm。我们推荐激发波长为630 + 20 nm，发射波长为680 + 20 nm的滤光片（图3）。  

图3. SiR探针的激发（蓝色）和发射（红色）光谱。

Q4。为什么SiR探针与其他荧光团相比具有低背景？

A4。SiR探针在近红外/远红光谱范围内被激发并发光，因此避免使用较短波长，例如通常自发荧光的蓝光和绿光，从而产生更高的背景信号。SiR偶联探针具有两种物理状态：1。非荧光，封闭的关闭状态（螺内酯）和2.开放的，高度荧光的开启状态（两性离子）。探针与其配体靶的结合有利于高度荧光的开放状态，而游离的未结合的探针以闭合的非荧光状态存在（图4）。荧光扩增从未结合状态到结合状态是100倍。这导致高灵敏度的生物传感器，其中大部分荧光仅在结合状态下发生（参见参考文献3和4）。 

图4.SiR衍生物存在于荧光两性离子（开放）形式（左结构）和非荧光螺（闭合）形式（右结构）之间的平衡中。

Q5：SiR探针在室温下是否稳定？

A5：是的，探头在室温下稳定几天。但是，它很大程度上取决于探针和溶剂。因此，建议将所有探针或溶液储存在-20°C。

Q6：SiR-肌动蛋白和SiR-微管蛋白对细胞有毒吗？

A6：是的，高于某一阈值，两种探针都显示出对细胞增殖和肌动蛋白或微管动力学改变的一些影响。然而，探针的毒性比其母体药物低几个数量级。在HeLa细胞中，肌动蛋白和微管动力学都不会在低于100 nM的浓度下发生改变。在此浓度下，SiR探针有效地标记微管和F-肌动蛋白，从而捕获高信噪比图像。

问题7：探针是否适用于固定细胞？

A7：SiR-肌动蛋白探针可与PFA固定的细胞一起使用。SiR-肌动蛋白在PFA固定的细胞中标记F-肌动蛋白与鬼笔环肽衍生物一样有效。SiR-微管蛋白仅在乙二醇 – 双 – 琥珀酰亚胺基 – 琥珀酸酯（EGS） – 固定的细胞中标记微管。然而，观察到PFA固定细胞的中心体微管的选择性标记。SiR-肌动蛋白和SiR-微管蛋白不适用于甲醇固定的细胞。

问题8：STORM可以成像SiR探针吗？

A8：否 – 在STORM成像中通常使用的非常高的光强度下，在活细胞上观察到光毒性效应。

Q9：哪些生物和组织被SiR探针染色？

A9：此列表仅描述已报告有效的细胞系，组织或生物。细胞系，组织或生物体的省略并不意味着SiR探针不能与特定细胞，组织或生物体一金畔挥作用。

智人：U2OS，成纤维细胞，HeLa，HUVEC，MCF-10A，HCT-116，A549，红细胞

Mus musculus：C2C12，IA32，骨骼肌，原代心肌细胞，原代卵母细胞

褐家鼠：原代海马神经元，原代皮层神经元，NRK

Cercopithecus aethiops：COS-7

Mesocricetus auratus：BHK

果蝇（Drosophila melanogaster）：Notum上皮细胞，S2

Didelphis marsupialis：OK细胞

Q10。SiR探针在3D细胞培养中起作用吗？

A10：是的，探针能够在3D生长环境中染色细胞。

问题11：SiR荧光团的校正因子CF ₂₆₀和CF ₂₈₀是多少？

A11：CF ₂₆₀ = 0.116，CF ₂₈₀  = 0.147

参考

1.地狱SW和Wichmann J. 1994. 通过受激发射破坏衍射分辨率极限：受激发射 – 耗尽荧光显微镜。选择。快报。19,780-782。

2. D'Este E.等。2015年STED纳米显微镜揭示了皮质细胞骨架的周期性的活神经元的普及。Cell Rep.10,1246-1251。

3. Lukinavicius G.等。2013年的近红外荧光的细胞蛋白的活细胞超分辨率显微镜。纳特。化学。5,132-139。

4. Lukinavicius G.等。2014. 用于细胞骨架的活细胞成像的荧光探针。自然方法。11,731-733。

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特色论文

“用于细胞骨架活细胞成像的荧光探针” ; G.Lukinavičius，L.Reymond，E。D'Este，A。Masharina，F.Göttfert，H。Ta，A.Güther，M。Fournier，S。Rizzo，H。Waldmann，C。Blaukopf，C。Sommer， DW Gerlich，H.-D。Arndt，SW Hell＆K。Johnsson; Nature Methods 11,731-733,2014。

“STED纳米显微镜揭示了活体神经元中皮质下细胞骨架周期性的普遍存在” ; E. D'Este，D。Kamin，F.Göttfert，A。El-Hady，SW Hell; Cell Reports，第10卷，第8期，1246 – 1251，2015年。

“近红外荧光团用于细胞蛋白的活细胞超分辨率显微镜检查” ; G.Lukinavičius，K。Umezawa，N。Olivier，A。Honigmann，G。Yang，T。Plass，V。Mueller，L。Reymond，IRCorrêaJr，Z。Luo，C。Schultz，EA Lemke，P。Heppenstall ，C。Eggeling，S。Manley＆K。Johnsson; Nature Chemistry 5,132-139,2013。

“动态肌动蛋白丝控制人体红细胞膜的机械行为” ; DS Gokhin，RB Nowak，JA Khoory，A。de la Piedra，IC Ghiran和VM Fowler; 摩尔。生物学。细胞; 2015年2月25日。

“可裂解的溶细胞素 – 神经肽Y生物结合物能够实现特定的药物传递并证明细胞内作用模式” ; VM Ahrens，KB Kostelnik，R。Rennert，D.Böhme，S。Kalkhof，D. Kosel，L。Weber，M。von Bergen和AG Beck-Sickinger; J.控制。发布; 209：170-178,2015。

“红色Si-罗丹明药物结合物能够在GFP细胞中成像” ; E. Kim，KS Yang，RJ Giedt和R. Weissleder; 化学。Commun。，50,4504-4507,2014。

“微管的边缘带在视网膜双极突触末端转运和组织线粒体” ; M. Graffe，D。Zenisek和J. Taraska; J. Gen Physiol。卷。146 No.one：109-117,2015。

应用笔记

“用于活细胞STED显微镜的明亮染料” ; S. Pitsch，I.Köster。

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