Wako 125-05061 赖氨酰肽链内切酶，MS级
Lysyl Endopeptidase®, Mass Spectrometry Grade (Lys-C)
赖氨酰肽链内切酶，MS级
品牌：Wako
CAS No.：
储存条件：-20℃
纯度：–
质谱级赖氨酰肽链内切酶
Lysyl Endopeptidase
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质谱级赖氨酰肽链内切酶
Lysyl Endopeptidase
本产品是质谱分析前处理时常用的蛋白分解酶即赖氨酰肽链内切酶，该酶可以特异性切除赖氨酸基团C末端的多肽，可用于蛋白测序分析和Lys-X化合物的酶合成。若同时使用赖氨酰肽链内切酶和胰酶，可更好地切断赖氨酸 基团的多肽，增加多肽的数量。产品已按照使用习惯做成小包装，是方便使用的冷冻干燥品。
来源：细菌
外观：冻干粉（包含2mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8）
活性：0.03～0.07AU/vial
分子量：27,000(琼脂糖过滤)，30,000（SDS-PAGE）
溶解性：溶于水或缓冲液
稳定性：溶解于pH值5.0-12.0的Tris缓冲液中，可在4℃稳定保存2年；在pH值6.0-11.0 30℃时能稳定保存，但温度超过50℃时不稳定。
最适pH值:9.0~9.5
等电点：6.9~7.0
底物特异性：
可水解底物——Tos-Lys-OMe,Bz-Lys-NH2,Bz-Lys-pNA,Lys-pNA
不可水解底物——Bz-Arg-NH2,Bz-Arg-pNA,Arg-pNA
抑制剂：DFP，PMSF，TLCK
◆特点
● 高特异性、高蛋白质消化率、适用于蛋白质谱分析
● 提高裂解效率、增加肽段数量
● 根据使用量特意制备小包装，方便使用
◆应用
分别采用胰蛋白酶(Tp)、赖氨酰肽链内切酶(Lep) 和Tp与Lep联用进行胶内酶切的效果比较。
牛血清蛋白BSA 的条带(100ng) 通过SDS-PAGE 获得，然后分别用Tp、Lep和Lep+Tp进行酶切，再用MALDI-TOFMS法进行分析。
这些蛋白酶的实验效果见下表。
表 1：Tp、Lep和Lep+Tp的结果对照
这些结果表明Lep酶解的错误裂解率低。Tp酶解时加入Lep后，错误裂解率有所降低，同时，可以鉴定出更多的多肽。
| Tp |
Lep |
Lep +Tp |
|
| 裂解位点 |
精氨酸和赖氨酸的C端 |
赖氨酸的C端 |
精氨酸和赖氨酸的C端 |
| 错误裂解率( 错误裂解所占比例 ) |
多(8%) |
很少(0%) |
少(3%) |
| 鉴定出的多肽数量 |
17 |
19 |
22 |
胰蛋白酶 (Tp)( 图 a) 和赖氨酰肽链内切酶 (Lep)+Tp ( 图 b) 酶切后的质谱结果对照图。
Lep+Tp酶切后，可以在m/z=2000时得到吸收峰，而单独的Tp酶切在m/z=2000时没有吸收峰。该结果表明Lep可以提高测序覆盖度。
( 数据由大阪医疗中心和妇婴健康研究所Y. Wada博士提供 )
赖氨酰肽链内切酶
赖氨酰肽链内切酶，最初由Masaki 等人从土壤细菌中分离得到。该酶可以特异性剪切赖氨酸残基C 末端和S-氨乙基半胱氨酸残基的肽键，用于蛋白测序和Lys-X 化合物的酶催化合成。该酶稳定性高，在4M 尿素或0.1%SDS 溶液中30℃孵育6小时之后，仍然拥有完整的生物活性。
| 外观 |
冻干粉（包含ca. 10% Tris-HCl buffer，pH 8） |
活性 |
见包装 |
| 分子量 |
27,000（凝胶过滤）；30,000 (SDS-PAGE) |
溶解性 |
易溶于水或缓冲液 |
| 最佳pH |
9.0-9.5（酰胺酶的最佳活性pH） |
等电点 |
6.9-7.0 |
| 抑制剂 |
DFP、PMSF、TLCK |
来源 |
细菌 |
| 稳定性 |
溶于pH 值5.0-12.0 的缓冲液中，可于4℃稳定保存。溶于pH值6.0-11.0的缓冲液中，可于30℃稳定保存，但是50℃及以上不稳定。 |
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| 单位定义 |
一单位酰胺酶(AU) 指在30℃ pH9.5 时每分钟产生1μmol对硝基苯胺所需的酶量。 |
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| 底物特异性 |
水解底物：Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA |
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| 非水解底物：Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA |
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实验方法：
1. 试剂：
A．0.2 mol/L AMP 缓冲液，pH值9.5
溶解4.2g的2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇于150 mL的水中，加入1 mol/L HCl调pH值至9.5，再加水使体积至200 mL。
B．2.5 mmol/L 底物溶液
溶解22.6 mg的N-苯甲酰基-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐于20 mL水中。
C. 2 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8
溶解0.24 mg的2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇于900mL水中，加入0.1 mol/L HCl调pH值至8，再加水使体积至1L。
D. 酶溶液
溶解1vial的赖氨酰肽链内切酶于1 mL的溶剂C中，可直接加入。
E．终止溶液
将55 mL水和45 mL乙酸混合均匀。
2. 步骤
| 试剂 |
检测样品 |
空白对照 |
| A |
2.6 mL |
2.6 mL |
| B |
0.3 mL |
0.3 mL |
| 30℃预培养5分钟 |
|
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| D |
0.1 mL |
– |
| C |
– |
0.1 mL |
| 立即混合均匀，30℃预培养25分钟 |
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| E |
1.0 mL |
1.0 mL |
3. 单位的定义
酰胺酶单位是指30℃ pH9.5时，每分钟产生1 umol对硝基苯胺的酶量。
AU/vial = [(a-b) / 25] × (1 / 9.62) × (4.0 / 0.1)
a. 检测样品中的吸光度
b. 空白对照中的吸光度
胶内酶切的实验操作流程
用聚硅酮处理的微量离心管和吸管端防止捕获任何蛋白。使用质谱分析用凝胶染色试剂盒，例如银染剂MS试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产品编号：293-57701）
1. 电泳分离蛋白质样品；
2. 从凝胶中切割蛋白质片断并放入微量离心管；
3. 使凝胶脱色（可使用质谱分析用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液）；
4. 加入300 uL乙腈到试管里，搅拌器振荡30分钟；
5. 去除乙腈，用Parafilm膜覆盖微量离心管。
6. 在Parafilm膜上打出针孔，真空干燥15分钟；
7. 100 uL 10 mmol/L DTT溶解于100 mmol/L 碳酸氢铵，56℃恒温1小时。
8. 室温冷却后，用等量的50mM碘乙酰胺溶解于100 mmol/L 碳酸氢铵，暗处恒温45分钟并涡旋；
9. 用100 uL 100 mmol/L碳酸氢铵洗涤凝胶片段10分钟；
10. 用300 uL乙腈干燥凝胶片段15分钟；
11. 用100 uL 100 mmol/L碳酸氢铵溶胀凝胶片段15分钟；
12. 用300 uL乙腈再次干燥凝胶片段15分钟；
13. 去除液相，真空干燥凝胶片段15分钟；
14. 用100 uL赖氨酸内切酶溶液*在冰水浴中溶胀凝胶片段45分钟；
*赖氨酸内切酶稀释于50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5；
15. 去除100 uL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段放在37℃ 10 uL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5中过夜；
16. 加入50 uL 20mmol/L碳酸氢铵20分钟内振荡凝胶片段3次抽提多肽；
17. 加入5%甲酸/50%乙腈20分钟内振荡凝胶片段3次抽提多肽；
18. 如果需要用Speed Vac.浓缩多肽；
19. 用ZipTip脱盐和纯化多肽；
20. 如果需要用弱真空浓缩多肽至2 uL；
21. 加入基质进行质谱分析。
注意：根据细菌的生理和形态特征分类，产品来源为水解无色杆菌，但是最近细菌分类学将这种细菌鉴定为产酶溶杆菌。
保存：暗处-20℃保存
规格：20 ug×5vial
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