cellutron​成人心肌细胞分离

成年大鼠/老鼠
货号：ac-7031

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Accutase细胞分离溶液

在体外培养黏附干细胞时，常常需要消化分离细胞，这种分离分散细胞的操作在细胞传代时常是必须的例行操作，但有时候如干细胞需要转染、计数以及分析检测（如流式细胞术）等情况也需要分离细胞操作的。对大多数应用，常用蛋白酶消化分离细胞，然而，这些酶（如胰酶）对干细胞是有害的，能作用细胞膜上的蛋白与基质，而且还需要淬灭失活。因此，这些酶作用干细胞时一定要严格控制以防止干细胞失去发育潜力与死亡。

Accutase^TM细胞分离溶液是一种胶原酶制备物，可安全有效的分离鼠源干细胞，不需要任何添加血清失活操作。用Accutase^TM细胞分离溶液分离鼠源干细胞传代培养数代，对干细胞生长形态、多潜能的标记抗原分子以及核型都维持的很正常。

Accutase^TM优点：

不需要失活步骤

几分钟内完成黏附细胞的分离

温和的分离细胞，可以获得zui大的细胞活力

zui高的铺板效率

不含哺乳动物需要与细菌产品

产品信息：

淋巴细胞分离简述

     作为一种重要的免疫细胞，淋巴细胞的数目及功能状态反应了机体所处的免疫状态，与一些先天或后天的免疫缺陷性疾病、传染性疾病以及恶性肿瘤等免疫功能障碍有关的疾病有密切关联。因此，研究淋巴细胞的免疫状态对多种疾病的诊断、预防及治疗都有着极为重要的意义。而淋巴细胞分离是研究淋巴细胞功能状态及其在细胞免疫中作用的关键步骤。

淋巴细胞分离来源主要是外周血（或淋巴组织细胞悬液），目前常规的淋巴细胞分离方法有基于淋巴细胞分离液的密度梯度离心法、HES沉降法、以及基于抗原抗体结合的磁珠与流式细胞分离法。本文就现在常用的几种淋巴细胞分离方法及其特点做一简要综述。

1、密度梯度离心法

该方法采用淋巴细胞分离液进行进行密度梯度离心分离得到淋巴细胞。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同从而导致各种细胞具有不同的密度，淋巴细胞分离液即是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离纯化的常用试剂。常用的淋巴细胞分离液有Ficoll淋巴细胞分离液和Percoll淋巴细胞分离液。

1.1. Ficoll-Hypaque密度梯度离心法

Ficoll是一种中性的蔗糖的多聚体，吸水性强，平均分子量为400,000，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。单一的Ficoll溶液分子量大，高浓度时增加粘度易导致细胞聚集，因此常用的Ficoll淋巴细胞分离液采用了降低Ficoll浓度，同时加入泛影葡胺增加密度的Ficoll-Hypaqu混合溶液，其密度在1.077左右，近于等渗，适用于分离外周血淋巴细胞和单个核细胞（PBMC，外周血淋巴细胞和单个核细胞比重为1.075左右）^【1】。利用该分离液作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集，红细胞与粒细胞由于密度较大故沉于分层液的底部，淋巴细胞和单核细胞（PBMC）的比重与分层液比重相近，故位于分层液界面上。^【2，3】

 Ficool淋巴细胞分离液是一种经典的淋巴细胞分离试剂，分离得到的PBMC纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。然而因其固定的密度，故只适用于PBMC、脊髓干细胞、骨髓干细胞的分离。

订货信息：

供应商               品名                    货号        规格

MP Biomedicals   Lymphocyte Separation Medium – LSM™  0850494X    100 mL  

biomarket       LymphoprepTM分离液          1114544      250ml

1.2. Percoll密度梯度离心法：

Percoll成分为硅化聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的颗粒，渗透压很低，粘度也很小，不穿透生物膜，对细胞无毒害无刺激，不引起细胞聚集，可形成高达1.3g／ml密度。特别的是percoll的颗粒直径大小不同，可在离心过程中自然形成连续的密度梯度，从而将不同密度的细胞分离出来。而且Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定，配置不同浓度（密度）时仅需通过用PBS(1x)或组织培养液稀释即可获得，广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。采用Percoll细胞分离液得到的细胞可直接用于基于荧光标记的细胞分选。^【4】

因此，Percoll细胞分离液不仅适用于外周血中PBMC的分离（单个核细胞和淋巴细胞分别处于不同的密度层），而且能将全血中的多种细胞分离出来（各种细胞处于相应的梯度层），还可根据不同实验室需要配置所需的连续密度梯度，分离特定的细胞或亚细胞组分。初步分离得到的PBMC可根据需要不同密度梯度的不连续梯度离心方法进行进一步细胞纯化，如纯化淋巴母细胞和去除死细胞以及富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化。^【5】

常用percoll浓度密度换算（Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液 为100％ Percoll，比重是1.127）

Percoll浓度(％)    70       60       50       40       30        20 

比重g／ml       1.090  1.077    1.067   1.056   1.043     1.031

订货信息：

供应商    货号           规格

GE    17-0891-01         1 L

GE    17-0891-01         100 ml

1.3. Iodixanol梯度离心法

Iodixanol是一种化学成分为碘海醇（Iohexo1）的白色、高亲水性粉剂，可以配成型的非离子密度梯度分离液。分子量为821，密度为2.1 g/ml，是非离子型的、对细胞无毒性的化合物，可用于细胞、细胞器、生物大分子、病毒等各种生物物质的分离或提纯^【6】。该分离液的密度可以通过测定其折射率来确定，配置后可以进行高温高压的灭菌。可根据需要配置成不同密度的梯度离心液，主要用于脂蛋白的分离，也可用于淋巴细胞分离纯化。^【7,8】

订货信息：

供应商              品名                        货号           规格

Axis-Shield      Nycodenz（粉剂）         AS1002424      1x500g

Axis-Shield  LymphoprepTM  分离管（即用型）   AS1019818    18Tubes x10ml

Axis-Shield   OptiPrepTM  分离液（即用型）AS1114542      1x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分离液（即用型）AS1114544    1x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分离液（即用型）AS1114545    4x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分离液（即用型）AS1114547    1x500ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分离液（即用型）AS1114547     6x500ml

Axis-Shield  NycoPrepTM 1.077  分离液（即用型）AS1114550  4x250ml

Axis-Shield  NycoPrepTM 1.077  分离液（即用型）AS1114551   1x250ml

2、羟乙基淀粉（HES）离心沉淀法

HES是一种由高分子量支链淀粉经降解、羟乙基化并进一步加工处理后制成的血浆代用品^【9】。自然状态下，HES与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞彼此以凹面相贴聚集而下沉，与血浆及单个核细胞形成清晰的界面。如果HES与外周血混合物经低速离心可加快红细胞的下沉，便于吸取含单核细胞层，使PBMC的分离过程简单化。该方法分离PBMC操作简便，成本低廉，分离细胞数量与密度梯度离心方法相当。然而该方法分离的细胞质量有待进一步提高。^【10-12】

订货信息：

国内多家血浆代用品供应商如湖北武汉康宝泰精细化工有限公司可以获得。 

3、基于免疫技术的淋巴细胞分离法

目前多家生物制品公司均开发出的基于抗原抗体特异性结合的淋巴细胞分离试剂盒，主要有免疫磁珠分离法、流式细胞分选法^【13,14】。这些试剂盒能特异性分离外周血或其它组织中的单一淋巴细胞类型，操作简便，所得细胞纯度高，可直接用于下游分子生物学实验。然而该法基于抗体技术，因此成本高，还未成为目前的主流淋巴细胞分离方法。

订货信息

供应商              品名                              货号

Stem cell   EasySep™ Magnet全淋巴细胞富集试剂盒    19961HLA

Stem cell   EasySep™ MagnetT细胞富集试剂盒         19951HLA

Stem cell   EasySep™ MagnetB细胞富集试剂盒         19954HLA

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主要参考文献：

1. Separation of human lymphocytes from citrated blood by density gradient (NycoPrep) centrifugation: monocyte depletion depending upon activation of membrane potassium channels. Bøyum A, Brincker Fjerdingstad H, Martinsen I, Lea T, Løvhaug D. Scand J Immunol. 2002 Jul;56(1):76-84.

2. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Bøyum A, Løvhaug D, Tresland L, Nordlie EM. Scand J Immunol. 1991 Dec;34(6):697-712.

3. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Bøyum A.

Scand J Immunol. 1976 Jun;Suppl 5:9-15.

4. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. de Almeida MC, Silva AC, Barral A, Barral Netto M. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3

5. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.

Pino PA, Cardona AE. J Vis Exp. 2011 Feb 2;(48). pii: 2348.

Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3.

6. Iodixanol梯度离心法分离脂蛋白. 党美林，林元喜. 《第七届海峡两岸心血管科学研讨会论文集》.2009年  

7. Su-Ting Chen, Jia-Yun Li, Yi Zhang. Recombinant MPT83 Derived from Mycobacterium tuberculosis Induces Cytokine Production and Upregulates  the Function of Mouse Macrophages through TLR2. The Journal of Immunology, 2012, 188: 668–677

8.Xingui Tian, Xiaobo Su, Xiao Li. Protection against Enterovirus 71 with Neutralizing Epitope Incorporation within Adenovirus Type 3 Hexon. PLoS ONE. July 2012,Volume 7, Issue 7 , e41381.

9.Forster H.Physical and chemical properties of hydroxyethylstarch.Plasˉma Volume Expansion，1992，105-121.

10.Rubinstein P，Dobrila L，Rosenfield RE，et al.Processing and cryopˉreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acad Sci，1995，92:10119-10122.

11.Denning-kendall P，Donaldson C，Nicol A，et al.Optimal processing of human
umbilical cord blood for clinical banking.Exp Hematol，1996，24:1394-1401.

12. 对外周血单个核细胞分离方法探讨. 韩亚萍 刘源 章莉莉 刘婷 李军 黄祖瑚 .中华现代临床医学杂志 2003年11月.1(9)

13.181-P: A rapid method to enrich specific lymphocyte populations (T cells, B cells, total lymphocytes) from whole blood. Karina L. McQueen, Jenna L. Warren, Allen C. Eaves, Terry E. Thomas.Human Immunology. Volume 68(1), Supplement: S106. 33rd Annual ASHI Meeting Abstracts October 2007

14. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Dagur PK, McCoy JP Jr. Curr Protoc Cytom. 2015 Jul 1;73:5.1.1-5.1.16