adsbiotec mRNA聚（A）尾蛋白中的磷酸二酯修饰简介

不影响蛋白质表达的去烯基化

多米尼卡·斯特泽莱卡，1,3米罗斯劳·斯米坦斯基，2,3帕维尔·J·西科尔斯基，2马辛·沃明斯基，1
1岁的乔安娜·科瓦尔斯卡和2岁的雅切克·杰米利特
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波兰华沙02-093华沙大学物理系实验物理研究所生物物理系
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华沙大学新技术中心，波兰华沙02-097
摘要化学修饰使mRNAs的制备具有更高的稳定性和翻译活性。在本研究中，我们探索了mRNA体和聚（A）尾中5′、3′磷酸二酯键的化学修饰如何影响真核mRNA的生物学特性。为了获得修饰和未修饰的体外转录mRNAs，我们使用ATP和
在α-磷酸（包含O-to-S或O-to-BH3替换）和三种不同的RNA聚合酶-SP6、T7和聚（A）聚合酶处修饰的ATP类似物。为了验证ATP类似物在ATP存在下的掺入效率，我们开发了一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于基于转录物*降解为5′-单核苷酸的定量评估修饰频率。该方法还估计了平均聚（A）尾长度，因此为建立mRNA的结构-生物学特性关系提供了一个通用工具。我们发现，与未修饰的mRNA相比，在聚（A）尾中含有硫代磷酸基团的mRNA更不易被3′-dedenylase降解，并在培养细胞中有效表达，这使它们成为有用的研究工具和未来基于mRNA的疗法发展的潜在候选。
关键词：去烯基化；mRNA修饰；抵抗；转录；翻译

由于应用分析方法的分辨率差，导致ITE长度增加，这又因多聚（A）尾异质性而变得复杂（Jalkanen等人，2014年）。最高分辨率测序方法，如TAIL-seq（Chang等人。
PAlso-seq（Subtelny等人2014年；Liu等人2019年）和FLAM-seq（Legnini等人2019年）提供了关于核苷酸序列、聚（A）尾长度和腺嘌呤修饰存在的信息。质谱分析
通过直接注入分析或结合色谱技术成功地用于RNA（包括mRNA）分析（Kowalak等人，1993年；
Gong和McCullagh 2014；Rose等人，2015年；韦策尔和林巴赫2016；Studzinska等人，2017年；Beverly等人，2018年；Lobue等人，2019年；Calderisi等人，2020年）。这种强有力的技术提供了有关RNA结构和功能的信息
组成，包括聚（A）尾长。尽管这是一种高分辨率和敏感的方法，但由于多电荷态和相关光谱的复杂性，长mRNA的分析可能很困难（Muddiman）
等人，1996年）。
在这项研究中，为了能够分析P-mod mRNA，我们开发了一种新的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，该方法能够同时量化修饰的磷酸化核糖核酸的数量-
双酯键和mRNA中聚（A）尾平均长度的估计（图1）。随后，我们应用该方法对携带硫代磷酸或磷酸硼砂修饰的IVT P-mod RNA进行了表征-
三种不同的RNA聚合酶可以使细胞大小不同。最后，对LC–MS/MS表征的P-mod mRNA进行了体外研究，以评估其对酶促脱烯基化的敏感性，并在培养细胞中评估磷酸二酯修饰对蛋白质表达的影响。我们瞥见了P-mod RNA的合成孔径雷达，并确定了与高效蛋白质表达兼容的修饰模式。