双荧光素酶报告基因检测试剂盒（高敏型）说明书

产品详情

产品描述

 报告基因检测常用于研究真核生物基因表达调控，萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶可以分别催化底物萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)发出生物萤光(bioluminescence)，这种发光反应具有良好的光学特征和浓度线性范围，同时检测的灵敏度高，可达到 10-20mol。两种催化反应最适浓度不同，因此互不干扰，配合使用形成一套高灵敏的双荧光素酶报告基因检测系统，其中海肾萤光素酶常作为内参照。

  萤火虫萤光素酶是一种分子量约为 61 kDa 的蛋白，在 ATP、镁离子和氧气存在的条件下，催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在此过程中会产生发射波长 560 nm 的生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为36 kDa的蛋白，在氧气存在条件下，催化腔肠素(Coelenterazine) 氧化成 coelenteramide，在此过程中会发出波长约为 480 nm 的生物萤光。在后加入海肾萤光素酶底物时，可有效淬灭萤火虫荧光素酶催化 luciferin 的发光，而不干扰海肾萤光素酶的活性，从而实现双萤光素酶报告基因检测。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或) 或多功能酶标仪进行测定。通过萤光素酶与其底物催化发光的体系，可以高效、灵敏地检测目的基因的表达。

 

产品组分

使用方法

使用方法

1. 试剂准备：

（1）1x Universal lysis Buffer 配置：取所需体积的 5x Universal lysis Buffer 临用前用三蒸水稀释至 1x 用；

（2）Fluc buffer A 工作液：试剂盒开启时，将 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate中，适当吹打摇匀至粉末充分溶解后分装到棕色管中-20℃保存备用；

（3）Rluc Buffer B 工作液：临用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀释至 1x 用（按需配置），配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 内使用有效。（试剂配置过程中注意避光）

2. 细胞裂解物制备:

弃去培养板中的培养液，加入足量 PBS 清洗一遍，细胞刮刮取收集沉淀(如为悬浮细胞直接离心弃上清收集沉淀)。细胞沉淀可-80℃保存，也可立即加入适量 1x Universal lysis Buffer 吹打混匀，液氮冻融三次，制备细胞裂解物。

细胞裂解液推荐使用量：

3. 萤光数值检测：

（1）荧光酶标仪设定， 选择生物发光检测功能，根据本批样本的灵敏度选择合适增益与积 分时间，默认为增益 135，积分时间 10 s。

（2）检测：

1) 移液枪吸取细胞裂解液 20 μL 到黑色孔板底部（充分混匀裂解物）；

2) 加入 100 μL Fluc buffer A，移液器轻柔快速吹打混匀三次，立即启动检测，记录发光值 （F 值）；

3)加入 100 μL Rluc buffer B，移液器轻柔快速吹打混匀三次，立即启动检测，记录发光值（R 值）。（因手动控制检测会导致时间误差较大，对结果有一定的影响，建议配备计时器，保证不同 样本之间反应和检测时长基本一致)

4.数据分析：

（1）实验设计：根据实验目的，每组实验均应设置空白对照组，对照组和处理组。

a.空白对照组

背景 F：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白对照组样品量须与实验样品量相同，且与实验样品含有相同的培养基/血清组合。

b. 对照组：转染细胞未经实验因素处理 (即对照组 F 和对照组 R)。

c. 实验组：转染细胞经实验化合物处理 (即实验组 F 和实验组 R)。

计算结果：对照组比值=(对照组 F-背景 F)/(对照组 R-背景 R)，

实验组比值=(实验组 F-背景 F）/(实验组 R-背景 R)。

表达倍数=实验组比值/对照组比值。

 

 

 

图 2.荧光素酶报告基因检测试剂盒操作示意图

实验案例分析

在六孔板中接种适量细胞过夜至贴壁状态，第二天用新鲜的空白培养基饥饿细胞 4h 后共转三个质粒：

1.含有法尼醇 X 受体（FXR）启动子区的荧光素酶报告基因表达载体质粒；

2.含有 FXR 启动子区转录因子 E2 功能区的表达载体质粒；

3.海参荧光素酶重组表达载体质粒。转染 6h 后更换为含有不同药物浓度的鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic acid，CDCA）和奥贝胆酸（Ocaliva，OCA）和Complete culture solution培养细胞 48h，最后按试剂盒说明书操作刮收沉淀，随后立即裂解进行荧光素酶报告基因活性检测，结果如下:

 

 

图 3（左）两个浓度（10μM，20 μM）CDCA 药物处理下，FXR 启动子区荧光素酶报告基因激动倍数图；

  （右）两个浓度（10μM，20 μM）OCA 药物处理下，FXR 启动子区荧光素酶报告基因激动倍数图

  （红色：金畔生物品牌产品测定结果；黄色：进口“P“品牌产品测定结果）。

注意事项

（1）反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养液平衡至室温（20-25℃）。

（2）检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同。

    检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光酶标板。

（3）发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响，应确保同组内不同样本检测条件一致。

（4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。

（5）本产品仅作科研用途！

双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (高通量）说明书

产品详情

产品描述

报告基因检测常用于研究真核生物基因表达调控，萤火虫萤光素酶 和海肾萤光素酶可以分别催化底物萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)发出生物萤光(bioluminescence)，这种发光反应具有良好的光学特征和浓度线性范围，同时检测的灵敏度高，可达到 10-20mol。两种催化反应最适浓度不同，因此互不干扰， 配合使用形成一套高灵敏的双荧光素酶报告基因检测系统，其中海肾萤光素酶常作为内参照。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为 61 kDa 的蛋白，在 ATP、镁离子和氧气存在的条件下，催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在此过程中会发出波长约为 560 nm 的生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为 36 kDa 的蛋白，在氧气存在的条件下，催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成 coelenteramide，在此过程中会发出波长约为 480 nm 的生物萤光。在后加入海肾萤光素酶底物时，可有效淬灭萤火虫荧光素酶催化 luciferin 的发光，而不干扰海肾萤光素酶的活性，从而实现双萤光素酶报告基因检测。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或)或多功能酶标仪进行测定。通过萤光素酶与其底物催化发光的体系，可以高效、灵敏地检测基因的表达。检测原理如图所示：

 

 

图 1.荧光素酶报告基因反应原理图

 

产品组成

试剂盒组分：

运输与保存

冰袋运输，-20℃保存 6 个月，-80℃保存更长时间。

实验步骤

1. 试剂准备：

（1）1x Universal lysis Buffer（ULB）配置：取所需体积的 5x Universal lysis Buffer 临用前用三蒸水稀释至1x；

（2）Fluc buffer A 工作液：试剂盒开始启用时，将 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate 中，适当吹打摇匀至粉末充分溶解后，分装到棕色管中-20℃保存备用；

（3）Rluc Buffer B 工作液：临用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀释至 1x 用（按需配置），配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 内使用有效（试剂配置过程中注意避光）。

2. 细胞裂解:

（1） 细胞裂解：取出孔板放置至恢复室温，加入适量体积 1x ULB 振荡器摇匀，室温裂解 15min。细胞裂解液推荐使用量：

 

 

（2） 荧光酶标仪设定，正确开启仪器，点击检测，选择生物发光检测功能，根据本批样本的灵敏度选择合适增益与积分时间，默认为增益 135，积分时间 10 s。

3. 检测：

1)移液枪吹打混匀裂解液后，吸取 20 μL 到黑色孔板底部。（样品数量过多时候建议使用移液枪经转移和后续加液操作，若使用四周不透光的培养板可省略转移操作）

2)向每孔中加入 100 μL Fluc buffer A，轻柔快速吹打混匀三次后，室温孵育反应 5-10min 后，上机检测记录发光值（F 值）。

  3)向每孔中加入 100 μL Rluc buffer B，轻柔快速吹打混匀三次后，室温孵育反应 5-10min 后，上机检测记录发光值（R 值）。

（为保证结果准确性，在加入 Fluc buffer A 或Rluc buffer B 后，请在 1h 内完成检测）

 

实验案例分析

在 96 孔板中接种适量细胞过夜至贴壁状态，第二天进行如下转染：1.含有FXR 基因启动子区的荧光素酶报告基因表达载体质粒；2.含有 FXR 基因启动子区转录因子 E2 功能的重组表达载体质粒；3.海参荧光素酶重组表达载体质粒。转染 6h 向每孔中加入不同单体药物培养 48h，其中设置空白溶剂 DMSO 组。最后按试剂盒说明书操作裂解随后进行荧光素酶报告基因活性检测，结果如下（对应孔中所标白色字体数值为阳性激动剂的激动倍数）

图 3 . 59 种单体药物对X 基因启动子区荧光素酶报告基因激动倍数热图（A1:为空白溶剂对照组；A2-J6: 59

种 FDA 上市药物的实验组）

经过上述实验的高通量筛选确定 F3 孔对应单体药物对FXR 启动子区激动效果强，激动倍数为 45。同某进口“P“品牌一同测定该药物对FXR 基因的激动曲线，并计算 EC₅₀，结果如下：

 

图 4.红色：金畔生物品牌测定 F3 单体药物激动 FXR 基因启动子区荧光素酶报告基因响应曲线；黄色：进口“P“品牌测定F3 单体药物激动 FXR 基因启动子区荧光素酶报告基因响应曲线（EC50）

1. 数据分析：

（1）实验设计：根据实验目的，每组实验均应设置空白对照组，对照组和处理组。

a. 空白对照组

背景 F：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白对照组样品量须与实验样品量相同，且与实验样品含有相同的培养基/血清组合。

b. 对照组：转染细胞未经实验因素处理 (即对照组 F 和对照组 R)。

c. 实验组：转染细胞经实验化合物处理 (即实验组F 和实验组 R)。

计算结果：对照组比值=(对照组 F-背景 F)/(对照组 R-背景 R)，实验组比值=(实验组 F-背景 F）/(实验组 R-背景 R)。

 

表达倍数= 实验组比值/对照组比值。

注意事项

（1） 反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养液平衡至室温（20–25℃）。

   （2） 检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同。 检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光酶标板。

（3） 发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响，应确保同组内不同样本检测条件一致。

（4） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。

    （5） 本产品仅作科研用途！