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Cygnus产品及应用选择指南 : |
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部分药品来源于生物组织，但产量有限，所以其价格十分昂贵。微生物/细胞生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。利用基因工程将合成相应药物成分的基因导入细胞内，让其产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。 基因工程图
基因工程大大改变了现有制药生产的状况，但是基因工程产品中残留的宿主细胞蛋白是影响制品纯度的重要因素,反复使用含宿主细胞蛋白的基因工程制品有可能引起机体的过敏反应。目前应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程主要采用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）作为宿主细胞。因制品中细胞蛋白残留量低 ,用常规的理化方法无法检测,为此需要建立细胞蛋白残留量测定方法,对半成品进行检定,从而更有效地保证制品的质量 ,提高制品的安全性。 Cygnus technologies, Inc.是美国一家专门从事生物工程和制药过程中残留物检测的一系列产品。生物制品生产过程中存在许多影响产品质量的残留物，诸如特殊重组表达系统中宿主细胞蛋白（ Host Cell protein, HCP ）的残留以及生物制品加工过程中培养物残留的污染物。公司提供了广泛而灵敏度*的一系列用于检测生物工程残留物的产品， Cygnus公司检测产品覆盖了常用于基因工程的培养细胞以及一些用于细胞培养的添加物。CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary），该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛培养的细胞。*批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种（乙肝疫苗）是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体（如白介素2），也不具有糖基化的功能（如EPO），而CHO却具有如上的功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞（fibroblast），是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因而检测起来很困难。 一、 Cygnus Elisa检测产品 共有39种Elisa 检测试剂盒，包括原核、真核表达细胞宿主蛋白检测试剂盒，细胞培养残留物检测试剂盒等。 公司产品：
1.CHO HCP ELISA kit（F015） zui常用的用于检测中国仓鼠卵巢细胞宿主蛋白试剂盒。 1）CHO HCP ELISA kit（F015）盒子组成
2）操作流程（中文操作流程仅供参考，实验请参照原装英文说明书） 客户可以根据检测灵敏度的需要，选择其中一种检测方法。
两种操作方法的比较：
2. E.coli HCP ELISA kit（F410） 针对利用E.coli生产相关药物的客户，检测大肠杆菌宿主蛋白残留物的利器。 1）E.coli HCP ELISA kit（F410）盒子组成 2）操作流程（中文操作流程仅供参考，实验请参照原装英文说明书）
3. Pichia pastoris HCP ELISA kit（F140） 真核表达系统（毕赤酵母）宿主细胞残留物检测试剂盒。 1）Pichia pastoris HCP ELISA kit盒子组成
2）两种不同的操作流程
两种操作方法的比较：
4. BSA ELISA kit （F030） 细胞培养添加物BSA的检测试剂盒。 1）BSA ELISA kit （F030）盒子组成
2）操作步骤
5. Protein A的检测试剂盒 针对开发抗体药，检测纯化过程中残留的Protein A，也有其他相关应用，分为三款F050、F050H和F400，其中F400是产品，是灵敏度zui高、效果的检测Protein A的试剂盒。 1）三个试剂盒的组成
2）三个试剂盒的差别
二、Cygnus WB检测产品 WB也是检测宿主细胞蛋白的手段，Cygnus的WB kits里的抗体跟相应的Elisa Kits是一样的，WB kits里面包括酶标抗体、阳性抗原、酶底物和封闭浓缩液，Cygnus的WB产品共有11种。具体产品可以参照下列（http://www.cygnustechnologies.com/category/western-blot-kits.html ） 部分WB产品：
三、 Cygnus免疫学产品 免疫学产品全部是Elisa和WB盒子里面的相关产品，提供抗体、抗原浓缩液（对照/标准品）、缓冲液和洗涤液等。 大部分抗体为山羊和兔来源，偶有猪抗，抗体货号有前后缀，不同后缀代表的意思不同。Cygnus抗体共有117种，众多抗体产品参照下列*：http://www.cygnustechnologies.com/category/antibodies.html 抗体的前缀/后缀代表的意义： PA或者PG是IgG片段 AF是亲和纯化的抗体 AF-AP偶联了AP的亲和纯化抗体 AF-B偶联了生物素的亲和纯化抗体 AF-HRP是偶联了HRP的亲和纯化抗体 下面为部分抗体产品：
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标签归档：指南
INCYTO C-WellTM技术指南
上海金畔INCYTO C-WellTM技术指南
使用INCYTO C-WellTM的通用、高通量和大小可控的细胞球体培养方案
一般信息
本指南的目的：
C-WellTM技术指南包含有关C-WellTM细胞球体培养平台的信息。本指南提供了球体形成和试剂制备的完整方案。
储存和有效期：
室温下储存时，C-WellTM的有效期为36个月。
不要重复使用，否则会遇到以下问题：污染、细胞球体形成失败和富含蛋白质的表面。
请勿将C-WellTM储存在紫外线辐射环境中。
预期用途：
仅供研究使用。不适用于人类或动物的诊断或治疗用途。
C孔描述TM
C-WellTM：
C-WellTM是一个革命性的细胞球体培养平台，以高通量的方式生成各种类型的尺寸控制的细胞球体。使用培养细胞球体的技术是一种悬滴法。
每个悬滴中的环境聚集细胞，然后形成单个球体。但悬滴法有几个局限性。悬滴法的主要局限性是：“劳动强度”、“低通量”、“培养时间相对较短”、“无法获得额外的新鲜生长培养基”和“细胞球体大小不均匀”。
与悬滴法相比，C-WellTM具有以下优势
任何其他商业化球体培养平台：“由于易于获得培养基更换，延长培养期10-30天”、“通过控制细胞接种密度，某些应用的培养期极短，为2-3天”、“无直接细胞-细胞接触的共培养准备系统，例如Transwell小室”、“生成尺寸受控的细胞球体”、“由于无剪切应力结构，易于改变装置中的生长培养基”、“适用于各种细胞类型”和“无限通量（一个装置可获得361个细胞球体）”。
方法
使用C孔制备用于细胞球体培养的试剂和材料TM
- 靶细胞生长培养基
- 胰蛋白酶/EDTA或ACCUTASETM
- 台盼蓝
- 磷酸盐缓冲液(PBS)1X
- 70%乙醇
- 100%乙醇
- 去离子水(DDW)，可选
- 牛血清白蛋白(BSA)4%溶液，可选
使用C孔制备细胞球体培养设备TM
- C-WellTM
- 锥形管（15 mL或50 mL）
- T75烧瓶或细胞培养皿
- 细胞过滤器（100 μm孔径）
- 皮氏培养皿（60 mm或100 mm，未处理）
- 血细胞计数器（例如DHC-N01、INCYTO）
- 移液器和吸头（1 mL和200 μL）
- 血清移液器及吸头(10 mL)
- 洁净工作台
- CO2培养箱
- 相差显微镜检查
- 吸引器
- 离心机
- 酒精灯
A. C孔预处理TM 细胞接种前
- 将生长培养基、1X PBS（或DDW）和100%乙醇加热至室温。
生长培养基的推荐近似体积为14 mL/1器械，1X PBS为24 mL/1器械，100%乙醇为8 mL/1器械。
- 在超净工作台中拆除C-WellTM的包装。
- 使用无菌镊子，从一个外缘朝向另一个外缘将C-WellTM置于60 mm培养皿上，以防止C-WellTM和培养皿之间产生气泡。
- 向制备的平皿中加入8 mL 100%乙醇。
- 用1 mL移液器反复移液，轻轻去除微孔中的气泡。
- 在培养皿一角抽吸100%乙醇。请勿在每个微孔中抽吸溶液。
- 向培养皿中加入8 mL 1X PBS，再次去除气泡。
- 在培养皿一角抽吸1X PBS。请勿在每个微孔中抽吸溶液。
- 重复上述7、8步两次。
- 向培养皿中加入7 mL生长培养基，并充分去除气泡。
- 将培养皿置于培养箱中至少24小时。
- 用1 mL移液器反复移液，轻轻去除微孔中的气泡。
- 在培养皿一角吸出生长培养基，并在细胞接种前加入7 mL新鲜生长培养基。
B-1.靶细胞单细胞悬液的制备（贴壁细胞用）
- 将生长培养基和适当浓度的胰蛋白酶/EDTA溶液预热至37 ℃。
- 加入10 mL 1X PBS，轻轻清洗细胞培养瓶(T75)或培养皿(100 mm)。
- 吸取1X PBS溶液。
- 加入2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，并将烧瓶置于37℃CO2培养箱中1 ~ 2 min（取决于细胞类型）。
- 轻轻敲击烧瓶，观察细胞。大部分细胞应分离
- 用4 mL生长培养基或适当的中和溶液中和胰蛋白酶/EDTA处理的细胞悬液。
- 通过反复移液*分离细胞。
- 用血细胞计数器计数细胞数量（例如INCYTO C-Chip、DHC-N01）
- 在适当离心力下离心细胞悬液。
- 通过抽吸去除上清液。
- 将细胞团块重悬于生长培养基中。细胞悬液的终接种密度和终体积应分别为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL和7 mL。这些值因细胞类型而异。
B-2.靶细胞单细胞悬液的制备（用于悬浮细胞）
- 将生长培养基和适当浓度的胰蛋白酶/EDTA溶液（可选）加热至37 ℃。
- 通过反复移液使细胞悬液均质化并解聚。
- 用血细胞计数器计数细胞数量（例如INCYTO C-Chip、DHC-N01）
- 在适当离心力下离心细胞悬液。
- 通过抽吸去除上清液。
- （可选）加入1 ~ 2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，置于37 °C CO2培养箱中1 ~ 2 min（细胞类型不同）。
- （可选）用2 ~ 4 mL生长培养基或适当的中和溶液中和胰蛋白酶/EDTA处理的细胞悬液（因细胞类型而异）。
- （可选）在适当离心力下离心细胞悬液。
- （可选）通过抽吸去除上清液。
- 将细胞团块重悬于生长培养基中。细胞悬液的终接种密度和终体积应分别为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL和7 mL。这些值因细胞类型而异。
- 使用C-Well形成细胞球体TM
- 将生长培养基加热至37 ℃。
- 用1 mL移液器反复移液，轻轻去除微孔中的气泡。
- 吸出培养皿一角的生长培养基，加入7 mL细胞接种密度为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL的细胞悬液
- 10 ~ 15 min后（因细胞类型而异），轻轻吸出细胞悬液，除去上清液细胞。
- 在培养皿一角加入7 mL生长培养基。
- 吸出混悬液，并在培养皿一角加入7 mL生长培养基。重复该步骤两次。确保该步骤结束时没有悬浮细胞是非常重要的。如果不是，这些悬浮细胞可能阻碍细胞球体的形成。
- 培养皿置37 °C CO2培养箱中孵育24小时。
- 每24小时更换一次培养皿中的生长培养基。
图1 MCF7球体的培养条件。细胞接种密度和清洗时间因细胞类型而异。应通过预实验确定适当的接种密度和洗涤时间。
图2 MCF7球体的形成。
图3 A549球体的形成。
图4 HepG2球体的形成。
图5小鼠神经干细胞(mNSC)球体的形成。与其他传统的球体培养方法相比，C-WellTM可以生成尺寸控制、形状均匀的细胞球体。
- 从C孔中分离细胞球体TM
- 将生长培养基加热至37 ℃。
- 用移液器直接吸取（带1 mL吸头）生长培养基至C-WellTM上。
- 重复上述步骤2，直至收集到大部分细胞球体。
- 轻轻移取细胞球体溶液。
- 将溶液添加到细胞过滤器的一个表面（顶部）。
- 翻转滤网，并将生长培养基添加到滤网的另一面（底部）。
- 将细胞球体铺板于未经处理的培养皿中。