3D培养和3D支架组织工程研究的有用工具

去端肽胶原，蜂窝海绵

Atelocollagen Honeycomb

◆背景

　　“蜂窝”胶原海绵具有方向统一、均匀的孔（200-400 μm），细胞可以穿透并在其中增殖密集地排列。这种结构有利于营养物质到海绵内为细胞做准备供应，并释放代谢废物和生化产物。细胞能够增殖且填充管腔，形成均匀的细胞团。

去端肽胶原蜂窝海绵 Atelocollagen Honeycomb Sponge (KOU-CSH-10) 为2 mm的立方体，应用于3D细胞 培养物和高密度细胞培养基组织工程细胞支架	去端肽胶原蜂窝海绵 Honeycomb Disk 96 （KOU-CSH-96）直径为6 mm圆盘形， 适用于96孔和高通量筛选细胞培养。
KOU-CSH-10 : stereoscopic microscope image 立体显微镜图像	KOU-CSH-96 : stereoscopic microscope image 立体显微镜图像
Electron microscope image of Honeycomb sponge 蜂窝海绵的电子显微图像	Electron microscope image of mouse fibroblast cell culture in 'Honeycomb collagen sponge 蜂窝胶原海绵小鼠成纤维细胞培养的电子显微镜图像

◆去端肽胶原的特点

　　去端肽胶原是由蛋白酶溶解的胶原，但是它的物理性质几乎与天然未加溶的胶原蛋白相同。而去端肽胶原更具有优越的特性。

◆特点与优点

　　“蜂窝”胶原海绵由高度纯化I型去端肽胶原制备（牛皮来源），并且可以通过胶原酶降解。

◆应用

　　3D培养

　　组织工程3D支架研究

◆使用实例

实例 1

NG1RGB人成纤维细胞在蜂窝圆盘（KOU-CSH-96）

	饲养层细胞/孔（×103）	附着细胞于蜂窝圆盘96（×103）
	10	2.2
	20	5.3
	40	8.6
细胞增殖：如图所示，在蜂窝圆盘96培养孔中接种。 细胞增殖通过NADH依赖性燃料（WST-8）测定OD值。	细胞附着：圆盘培养如图所示，培养一天后转移至新培养孔，并测定细胞数，显示20%的细胞附着。

实例 2

胚体在蜂窝海绵支架体内移植后的胚体致畸移植

　　小鼠肾脏在海绵蜂窝支架移植（EB/+CSH）胚体移植后12周后，没有形成畸胎瘤的迹象，而无KOU-CSH-10（ES/-CSH）的所有小鼠胚体培养产生畸胎瘤。组织学上，移植ES/+CSH与相邻的主肾组织没有明显区别，表明没有具体的诱导自发分化难以区分。

　　方法：板中培养小鼠胚胎干（ES）细胞进行胰蛋白酶处理，通过尼龙网过滤，接种到96孔板（1×10⁴ 细胞/孔），培养5天，形成胚状体（EB）。当EB与蜂窝海绵（KOU-CSH-10）混合，EB迅速、均匀融入KOU-CSH-10的矩阵中。EB/+CSH复合物移植到6周龄小鼠的肾筋膜。

实例 3

　　体内小鼠胚胎干/间质细胞镶嵌球移植KOU-CSH-10支架后新生毛发。
　　

　　方法：小鼠ES细胞和小鼠胚胎间充质细胞（MDU1）共培养以产生两种细胞的镶嵌球体。镶嵌球体与KOU-CSH-10去端肽胶原蜂窝海绵混合，在6周龄小鼠的背部肌肉移植。

<参考文献>
1. Suzuki T, et al. Growth inhibition and differentiation of cultured smooth muscle cells depend on cellular crossbridges across the tubular lumen of type I collagen matrix honeycombs. (2009) Microvasc Res. 77(2):143-149.

◆相关产品

细胞培养胶原：AteloCell

Atelocollagen, Native collagen

去端肽胶原，天然胶原
Atelocollagen powder

去端肽胶原粉末 

组织培养胶原溶液是KOKEN（东京）生产的高纯度的胶原溶液，先进的实验室生成，优良的品质控制。
[KOU-IPC-30, KOU-IPC-50, IAC-30, IAC-50, KOU-CLP-01]

Atelocollagen, Eagle's MEM, Hanks' Medium, DMEM

Atelocollagen, Eagle's MEM, DMEM 和 RPMI是用于培养的高纯度胶原溶液。
[KOU-MEN-02, KOU-DME-02, KOU-DME-02H, KOU-RPM-02]

Collagen microspheres

胶原微球

胶原微球用来源于牛皮的I型端肽胶原制备的细胞培养基材。该产品可用于培养，如成纤维细胞，上皮细胞和成骨细胞，并已被证明在细胞培养物的长期维持有效。
[KOU-MIC-00]

Atelocollagen,  Honeycomb sponge for cube-shaped and 96-well plate

去端肽胶原，蜂窝海绵立方体和96孔板

蜂窝”胶原海绵由高纯度的牛皮来源I型去端肽胶原制备，并且可以通过胶原酶降解。
[KOU-CSH-10, KOU-CSH-96]

Atelocollagen sponge, Collagen sponge for 35mm culture dish and <90 mm×80 mm×5 mm>

去端肽胶原海绵，35 mm培养盘与<90 mm×80 mm×5 mm>胶原海绵

胶原海绵为3D细胞培养开发的一种胶原的产品。
[KOU-CS-35,KOU-CLS-01]

Atelocollagen sponge, MIGHTY

去端肽胶原海绵，MIGHTY

MIGHTY是强力的胶原海绵，即使施加30kPa（单次）的压缩负荷也不会崩溃。
[KOU-CSM-25, KOU-CSM-50]

Atelocollagen, Permeable membrane for 50mm culture dish

去端肽胶原，50 mm培养皿半透膜
Atelocollagen membrane

去端肽胶原膜

胶原膜用高纯度牛皮来源I型去端肽胶原特别制备，用于单层和双层组织培养的研究。
[KOU-MEN-01,KOU-CLF-01]

Atelocollagen, Permeable membrane for 6-well,24-well culture plate, Atelocollagen membrane

去端肽胶原，6孔，24孔培养板，去端肽胶原膜半透膜

由于膜透明，培养时可用显微镜观察细胞。
[KOU-CM-6, KOU-CM-24, KOU-CLF-01]

Type II Collagen II型胶原
Usefull for tissue and cell culture可用于组织和细胞培养[KOU-CL-22]

Atelocollagen coated BETA-TCP scaffold

去端肽胶原涂层BETA-TCP支架
可用于成骨细胞研究[KOU-ACB-05S]

AteloCell 培养胶原

AteloCell^® 系列常见问题（FAQ）

AteloCell^® 系列非常适合从日常细胞维持到再生医学基础研究的细胞培养

◆脂肪变性胶原海绵 35 mm 培养皿

Q1：胶原蛋白海绵是否耐热？ 它能承受的最高温度是多少？ 当温度升高到高于体温的温度时，它会降解吗？
A1：我们没有测量这种产品的耐热性。以下信息供您参考，由于液体胶原变性在40°C左右，海绵型胶原可能不会变性，除非达到更高的温度。

Q2：这种胶原蛋白的弹性是什么？ 它会容易撕裂吗？ 它能承受多少重量？ 最重要的是，在处理胶原时，我们应该注意哪些？

A2：我们没有测试这种产品的弹性。然而，它可能抵抗一定水平的负载，因为这种产品是冻干的不溶性胶原蛋白。

Q3：它是否适合移植，例如皮肤移植用于伤口愈合？
A3：这不适合移植，因为是没有消除端肽的天然胶原。

Q4：胶原蛋白海绵会溶解吗？ 他们如何溶解？ 大概需要多长时间才能使它们完全溶解，特别是移植（如皮肤细胞）到/入动物模型后？ 

        当胶原溶解时，培养的细胞会发生怎么样的变化？

A4：本产品由不溶性胶原蛋白制成，因此不易溶解。在体内情况下，它会在MMP中溶解。虽然该产品不适合移植，但有报道称该产品用于体

        内实验。 根据报告，胶原在8周后从活体中移除。移植胶原被认为将可以取代移植细胞的胞外基质，直到其消失。

Q5：我们可以用手术刀手动切割胶原片到更小的尺寸吗？ 在切割过程中和切割后会造成胶原片/结构/完整性的破坏/扭曲/分散吗？

A5：你可以切割胶原板，但如果你使用钝刀，孔结构可能会皱起来。

Q6：细胞会以多大强度/完好地吸附到胶原海绵？ 即使在强烈搅拌后细胞能否容易分离？
A6：即使在强烈搅拌后，一旦细胞附着，也不容易分离，除非低粘附性细胞。

Q7：我们如何能够以最小损伤从胶原海绵中分离细胞？
A7：请使用胶原酶分离胶原。

◆胶原海绵，90×80×5 mm

Q1：吸水后变形的胶原海绵的厚度是多少？
A1：它将变得略小于5 mm。

Q2：一旦吸收水，海绵将变形，除非进行交联。 这方面的交联是什么意思？
A2：考虑通过UV或γ辐射的物理交联或通过交联剂的化学交联。

Q3：胶原海绵是否耐热？ 它能承受的最高温度是多少？ 当温度升高到高于体温的温度时，它会降解吗？
A3：我们没有测量这种产品的耐热性。以下信息供您参考，由于液体胶原变性在40°C左右，海绵型胶原可能不会变性，除非达到更高的温度。

Q4：这种胶原蛋白的弹性是什么？ 它会容易撕裂吗？ 它能承受多少重量？ 最重要的是，在处理胶原时，我们应该注意哪些？

A4：我们没有测试这种产品的弹性。然而，它可能抵抗一定水平的负载，因为这种产品是冻干的不溶性胶原蛋白。

Q5：它是否适合移植，例如皮肤移植用于伤口愈合？
A5：这不适合移植，因为是没有消除端肽的天然胶原。

Q6：胶原蛋白海绵会溶解吗？ 他们如何溶解？ 大概需要多长时间才能使它们完全溶解，特别是移植（如皮肤细胞）到/入动物模型后？ 

        当胶原溶解时，培养的细胞会发生怎么样的变化？

A6：本产品由不溶性胶原蛋白制成，因此不易溶解。在体内情况下，它会在MMP中溶解。虽然该产品不适合移植，但有报道称该产品用于体内

        实验。根据报告，胶原在8周后从活体中移除。移植胶原被认为将可以取代移植细胞的胞外基质，直到其消失。

Q7：我们可以用手术刀手动切割胶原片到更小的尺寸吗？ 在切割过程中和切割后会造成胶原片/结构/完整性的破坏/扭曲/分散吗？

A7：你可以切割胶原板，但如果你使用钝刀，孔结构可能会皱起来。

Q8：细胞会以多大强度/完好地吸附到胶原海绵？ 即使在强烈搅拌后细胞能否容易分离？
A8：即使在强烈搅拌后，一旦细胞附着，也不容易分离，除非低粘附性细胞。

Q9：我们如何能够以最小损伤从胶原海绵中分离细胞？
A9：请使用胶原酶分离胶原。

◆胶原，可渗透膜

Q1：膜是否耐热？ 它能承受的最高温度是多少？ 当温度升高到高于体温的温度时，它会降解吗？
A1：我们没有测量这种产品的耐热性。以下信息供您参考，由于液体胶原变性在40°C左右，海绵型胶原可能不会变性，除非达到更高的温度。

Q2：膜的弹性是什么？ 它会容易撕裂吗？ 它能承受多少重量？ 最重要的是，在处理膜时，我们应该注意哪些？
A2：我们没有测试这种产品的弹性。然而，它会容易撕裂，因为这种产品被再加工成薄膜形式。

Q3：它是否适合移植，例如皮肤移植用于伤口愈合？
A3：是的。

Q4：渗透膜会溶解吗？ 他们如何溶解？ 它需要多长时间才能使它们完全溶解，特别是移植（皮肤细胞）到动物模型后？ 

        当胶原溶解时，培养的细胞会发生哪些变化？

A4：我们认为可透膜在移植后约一个月会溶解。

Q5：我们可以用手术刀手动切割膜到更小的尺寸吗？ 它会在切割过程中和切割后引起膜结构/完整性的破坏/变形/分散吗？

A5：是的，你可以将膜切成更小的尺寸。

Q6：细胞粘附/附着到可渗透膜上的强度/完整性是什么样的，特别是当我们在膜的双面上进行两种不同细胞类型的夹心培养时？ 

        即使在强烈搅拌后细胞是否容易分离？

A6：即使在强烈搅拌后，一旦它们附着，细胞也不容易分离，除非低粘附性细胞。

Q7：我们如何能够从双侧膜以最小的损伤分离细胞？
A7：请用刮刀或胶原酶回收细胞。

Q8：如何在膜的两个不同表面上观察两种不同的细胞类型？ 我们用镊子翻转？ 这种行为是否会造成细胞损伤或脱落？

A8：您可以通过相差显微镜观察细胞。然而，难以区分细胞接种于哪一侧。因此，更好的方法是用荧光素标记细胞并通过荧光显微镜观察。

Q9：可以将膜从50 mm培养皿，6孔和24孔培养板上分离下来吗？
A9：可用刀把它分开。

◆胶原，蜂窝海绵

Q1：如何确保培养的细胞粘附在蜂窝海绵上？ 我们可以在显微镜下观察吗？
A1：相差显微镜能够观察。

Q2：蜂窝海绵是否耐热？ 它能承受的最高温度是多少？ 当温度升高到高于体温的温度时，它会降解吗？
A2：我们没有测量这种产品的耐热性。以下信息供您参考，由于液体胶原变性在40°C左右，海绵型胶原可能不会变性，除非达到更高的温度。

Q3：蜂窝海绵的耐久性是什么？ 它能承受多少重量？
A3：我们没有测试这种产品的弹性。然而，它会被负载打破，因为这种产品是冻干低浓度胶原。

Q4：蜂窝海绵会溶解吗？ 他们如何溶解？ 它需要多长时间才能使它们完全溶解，特别是移植（如皮肤细胞）到/入动物模型后？ 

        当蜂窝海绵溶解时，培养细胞会发生哪些变化？

A4：移植后约一个月，海绵会溶解。

Q5：我们可以用手术刀手动切割蜂窝海绵到更小的尺寸（更薄）吗？ 在切割过程中和切割后，是否会导致海绵结构的破坏/变形/分散？

A5：你可以切割胶原板，但如果你使用钝刀，孔结构可能会皱起来。

Q6：细胞粘附/附着到蜂窝海绵上的强度/完整性如何？即使在强烈搅拌后细胞是否容易分离？
A6：即使在强烈搅拌后，一旦它们附着，细胞也不容易分离，除非低粘附性细胞。

Q7：可以通过胶原酶处理，简便地收获细胞。处理后会影响细胞活力吗？有何处理方案？
A7：请加胶原酶至终浓度为0.1％，溶解约30分钟。如果你担心细胞损伤，提高胶原酶浓度和减少处理时间。

◆羊毛脂海绵（MIGHTY）

Q1：MIGHTY海绵是否耐热？ 它能承受的最高温度是多少？ 当温度升高，例如高于体温时，它会降解吗？
A1：我们没有测量这种产品的耐热性。以下信息供您参考，由于液体胶原变性在40°C左右，海绵型胶原可能不会变性，除非达到更高的温度。

Q2：MIGHTY海绵会溶解吗？ 他们如何溶解？ 它需要多长时间才能使它们完全溶解，特别是移植（如皮肤细胞）到/入动物模型后？ 

        当MIGHTY溶解时，培养的细胞会发生哪些变化？

A2：因为MIGHTY海绵是高强度海绵，它难以溶解。有一个数据表明MIGHTY海绵移植后至少3个月内不会溶解。

Q3：我们可以用手术刀手动切割MIGHTY海绵到更小的尺寸吗？ 在切割过程中和切割之后，是否会导致MIGHTY结构的破裂/变形/分散？ 

        在切割过程中是否有任何的推荐步骤或预防措施？

A3：当它是膨胀状态，你可以切割MIGHTY海绵。然而，刀切割海绵后，可能会有切口，因为这是一种高强度的海绵。

Q4：细胞粘附/附着到MIGHTY海绵上的强度/完整性？即使在强烈搅拌后细胞也能很容易分离吗？
A4：即使在强烈搅拌后，一旦它们附着，细胞也不容易分离，除非低粘附性细胞。

Q5：我们如何将细胞以最小损伤从MIGHTY海绵中分离？
A5：因为MIGHTY海绵是高强度的，所以难以从海绵中回收活细胞。另一方面，在均质化之后回收核苷酸或蛋白质是可行的。

◆胶原微球

Q1：微球胶原蛋白的上清液/溶液是什么？
A1：PBS

Q2：如何确保培养的细胞粘附到微球？ 我们可以在显微镜下观察吗？
A2：你可以通过相差显微镜观察。

◆胶原涂层B-TCP（B-磷酸钙）支架

Q1：这个支架的厚度是多少？
A1：1.0±0.1 mm

Q2：支架是否耐热？ 它能承受的最高温度是多少？当温度升高，例如高于体温时，它会降解吗？
A2：β-TCP支架可以耐高温，但是涂覆的胶原在40℃左右变性。

Q3：支架的弹性如何？ 它会容易撕裂/破裂吗？ 它能承受多少重量？ 最重要的是，在处理胶原时，我们应该注意哪些？

A3：我们没有测试这种产品的弹性。然而，我们认为支架是来自β-TCP，它可以承受一定负载。

Q4：它适合移植吗？
A4：是。 但本产品设计用于骨形成测定。

Q5：支架会溶解吗？ 他们如何溶解？ 需要多长时间才能使它们完全溶解，特别是移植到动物模型之后？ 

        当支架溶解时，培养的细胞会发生哪些变化？

A5：很难溶解，因为这个产品是由β-TCP组成。

Q6：我们可以用手术刀手动切割支架到更小的尺寸吗？ 在切割过程中和切割后会引起支架结构的破坏/变形/分散吗？

A6：很难切割，因为这个产品是由β-TCP组成。

Q7：细胞粘附/附着到支架上的强度/完整性如何？即使在强烈搅拌后细胞是否容易分离？
A7：即使在强烈搅拌后，一旦细胞附着，也不容易分离，除非低粘附性细胞。

Q8：我们如何能够以最小的损害从支架上分离细胞？
A8：请使用胶原酶分离胶原。

Atelocollagen, Honeycomb sponge

Product number : KOU-CSH-10, KOU-CSH-96

<References>

1.	Ishii I,  et  al.  Correlation between antizyme 1 and differentiation of vascular smooth muscle cellscultured in honeycomb-like type-I collagen matrix. Amino Acids. (2012) Feb;42(2-3):565-75.
2.	Ishii I, et al. Histological and functional analysis of vascular smooth muscle cells in a novel culture system with honeycomb-like structure. At herosclerosis. (2001) Oct;158(2):377-84.
3.	Mariko Yamaki: in vitro and de novo generation of hair from mosaic spheres formed jointly from ES and mesenchymal cells. The Japanese Society for Regenerative Medicine magazine. (2009)8(2):91-97.
4.	Mariko Yamaki: Artificial extracellular matrix of type I collagen can suppress the tumorigenetic potential of mouse embryonic stem cells. The Japanese Society for Regenerative Medicine magazine. (2009) 8(1):109-114.
5.	Suzuki T, et al. Growth inhibition and differentiation of cultured smooth muscle cells depend on cellular crossbridges across the tubular lumen of type I collagen matrix honeycombs. (2009) Microvasc Res. 77(2):143-149.
6.	Fukui N, et al. Bone tissue reaction of nano-hydroxyapatite/collagen composite at the early stage of implantation. (2008) Biomed Mater Eng. 18(1):25-33.
7.	Fukushima K, et al. The axonal regeneration across a honeycomb collagen sponge applied to the transected spinal cord. (2008) J Med Dent Sci. 55(1):71-79.
8.	Kakudo N, et al. Bone tissue engineering using human adipose-derived stem cells and honey comb collagen scaffold. (2008) J Biomed Mater Res A. 84(1):191-197.
9.	Saeki K, et al. Highly efficient and feeder-free production of subculturable vascular endothelial cells from primate embryonic stem cells.(2008) J Cell Physiol. 217(1):261-280
10.	Takeuchi R, et al. Low-intensity pulsed ultrasound activates the phosphatidylinositol 3 kinase/Akt pathway and stimulates the growth of chondrocytes in three-dimensional cultures: a basic science study. (2008) Arthritis Res Ther. 10(4):R77.
11.	Hidetsugu T, et al. Mechanism of bone inducti on by KUSA/A1 cells using atelocollagen honeycomb scaffold. (2007) J Biomed Sci. 14(2):255-263.
12.	Rodriguez  AP,  Missana L, Nagatsuka H, et  al.:  Efficacy of atelocollagen honeycomb scaffold in bone formation using KUSA/A1 cells. J Biomed Mater Res A. (2006) 77(4):707-717.
13	George J, et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts on honeycomb collagen scaffolds. (2006) Biotechnol Bioeng. 95(3):404-411.
14.	Imamura T, et  al. Embryonic stem cell-derived embryoid bodies in three-dimensional culture system form hepatocyte-like cells in vitro and in vivo. (2004) Tissue Eng. 10(11-12):1716-1724.
15.	Itoh H, et al. A honeycomb collagen carrier for cell culture as a tissue engineering scaffold.(2001) Artif Organs. 25(3):213-217.
16.	Moriyama T, et  al. Development of composite cultured oral mucosa utilizing collagen sponge matrix and contracted collagen gel: a preliminary study for clinical applications. (2001) Tissue Eng.7(4):415-427.