firebirdbio自回避分子识别系统


firebirdbio自回避分子识别系统(SAMRS 

核酸扩增反应遭受脱靶扩增产物的形成。该问题随着反应中引物的数量而增加,并且主要由于引物-引物相互作用而发生。因此,从引物碱基中选择性除去氢键合单元会导致产生自我逃避的DNA引物,可以添加这些引物以实现和改善多重PCR。

 

如下所示,带*的SAMRS碱基可以与标准碱基(在靶标或扩增子中)成对,但不能与其他SAMRS碱基成对。

            
                                    

 自回避分子识别系统-SAMRS TM
亚磷酰胺和寡核苷酸

 

 

T* phosphoramidite
1g $1050
10g $8220
A* phosphoramidite
1g $655
10g $5340
C* phosphoramidite
1g $394
10g $3150
G* phosphoramidite
1g $110
10g $880

 

 

含有SAMRS的寡核苷酸:

 

将SAMRS碱基放入PCR和其他扩增技术所用引物中的一般规则。大写字母表示标准基数,小写字母表示SAMRS基数。 

 

  • 建议长度为20-35 nts。SAMRS碱基应在寡核苷酸3'末端的前4至5个位置使用,而不是在前面的3'碱基中使用。
  • 每个寡核苷酸应使用两个至四个SAMRS碱基,优选两个或三个SAMRS修饰。
  • SAMRS t碱基在引物二聚体的形成方面没有显示出太多的减少,因此在选择时好用a,g或c代替t。
  • 避免在由三个和四个连续相同的碱基组成的字符串中使用SAMRS碱基。例如:应避免使用ggg,ccc,aaa,ttt,gggg,cccc,aaa和tttt。
  • SAMRS碱基与标准碱基分开,例如:gGg,cCc,aaAA和tTt。
  • 如果寡核苷酸的3'末端为标准A或T,则第二个碱基也应为标准碱基,然后进行两个或三个SAMRS修饰。

 

Firebird还准备SAMRS寡核苷酸文库。

SAMRS可以在寡核苷酸中与AEGIS结合使用,以实现高度复用和高度清洁的PCR和等温扩增。请咨询。

 

与所有引物设计一样,Firebird无法保证遵循这些规则制成的寡核苷酸的性能。

 

Benner等人,2015;Glushakova et al。,2015a,2015b; Hoshika et al。,2010; Sharma等,2014;Yang等人,2015年和未发布的数据

 

 

T* phosphoramidite
1g $1050
10g $8220
A* phosphoramidite
1g $655
10g $5340
C* phosphoramidite
1g $394
10g $3150
G* phosphoramidite
1g $110
10g $880

点突变试剂盒1.0说明书

点突变试剂盒1.0说明书

产品详情  

货号

规格

价格

78BDA10006-10次

10次

560.00

78BDA10006-20次

20次

896.00

78BDA10006-50次

50次

1820.00

产品描述

本试剂盒可以在质粒DNA序列中任意位点引入特定的定突变,包括碱基插入、碱基deletion、碱基变换等。

首先用高保真DNA聚合酶与带有突变碱基与硫代修饰的引物,PCR扩增野生型质粒,将质粒线性化并引入突变位点,然后用化学重组试剂将质粒重组成环状质粒。扩增质粒的一对引物各自5'末端的10-12个碱基互补配对,用于重组环化质粒。将带有突变碱基的线性化质粒PCR产物用化学重组试剂处理环化质粒,然后进行DH5a转化,完成基因定点突变。

本公司化学法突变试剂盒含有高保真DNA聚合酶2XPCR Mix、化学重组试剂,可以从头到尾完成整个实验,极大的方便了实验操作。另有无高保真DNA聚合酶2XPCR Mix的化学法突变试剂盒。

产品特点

DNA定点突变,包括碱基插入、碱基deletion、碱基变换等。

产品组分

组分

78BDA10004

78BDA10004

78BDA10004

2×PCR Mix

250 μl

500 μl

1250 μl

化学重组试剂

20 μl

40 μl

100ul

10X化学重组buffer

20 μl

40 μl

100ul

突变线性质粒DNA

50ul

100ul

250ul

使用方法

使用方法

01. 设计突变引物

引物设计总原则:在正反向扩增引物的5'端引入末端互补同源序列,使扩增后的线性化质粒片段5'3'末端带有10-12个碱基的同源序列,用于重组环化质粒。

正向扩增引物设计原则:5'-末端同源序列+突变位点+硫代修饰位点+目标序列特异性正向配对序列-3'

反向扩增引物设计原则:5'-末端同源序列+突变位点+硫代修饰位点+目标序列特异性反向配对序列-3'

正/反向扩增引物与质粒模板的特异性配对序列Tm55-65℃为佳,末端同源区序列长度为10-12 个碱基(一般情况同源区10个碱基足以)。

一般引物不需PAGE纯化,如果最终引物长度超过40 bp,推荐合成时选用PAGE纯化,有助于提高PCR与点突变成功率。

02. 反向PCR扩增线性化质粒,并引入突变位点

为了防止突变位点之外的碱基额外突变,确保使用高保真聚合酶进行反向PCR50ulPCR体系中,推荐使用1-5ng 环状质粒模板。限制性内切酶DpnI处理PCR产物,可以降低野生型质粒形成的克隆数。由于本突变试剂盒效率高,可省略DpnI消化处理,对突变成功率影响不大。

03. 重组环化反应的线性化质粒使用量

无需精确计算化学法重组反应的线性化质粒PCR产物加入量,一般使用3-5ul

04. 质粒重组环化反应

1)室温配制以下反应体系:

组分            重组反应a     阴性对照b       阳性对照c

线性化质粒       X μl           X μl              5 μl

化学重组试剂     2 μl           0 μl              2 μl

ddH20         to 10 μl        to 10 μl           to 10 μl

a. 割胶纯化的PCR产物进行重组反应时,一定在重组反应体系中加入1/10体积的化学重组Buffer

b. 用来确认野生型环状质粒残留,推荐进行。

c. 突变线性质粒DNA阳性对照反应可用来排除其他实验材料及操作因素的影响。

2)轻柔混匀后,在70℃反应8-10 min,置于室温或冰上冷却。

PCR仪及其它加热仪器上进行反应,重组环化效率在反应8-10 min左右达到最高。

重组环化产物可于-20℃存放1个月,待需要时解冻转化即可。

05.重组环化质粒产物转化

在冰上解冻克隆感受态细胞,冰上放置15min

5ul重组环化产物加入到50ul感受态细胞中,轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀),冰上静置15-20 min重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/5

42℃水浴热激1-2min后,立即置于冰上冷却1- 2 min

加入450 μl SOCLB培养基(不添加抗生素)37℃摇菌30min-1h (转速200 – 250 rpm)

将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热30min(可省略)。

直接吸取20-100ul菌液到含有正确抗性的平板上,用无菌涂布棒涂匀。

37℃培养箱中倒置培养12 – 16 h

06.点突变测序鉴定

过夜培养后,重组环化反应转化平板上形成数百个单克隆,而不加化学重组试剂的阴性对照反应转化平板上的克隆数应显著少于前者。

挑取重组反应转化平板上2-3个克隆进行DNA序列测定,验证是否突变成功。

注意事项

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作!

本产品主要用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

运输及保存方法

干冰运输。-20℃保存,有效期2年。