QuickZyme Biosciences是一家创新的生命科学公司，为研究界提供新颖*的产品，这些产品在基质相关蛋白，酶和测定法领域具有附加值。

上海金畔Quickzyme QZBtotcol1现货使用说明书

介绍

胶原是细胞外基质的主要成分之一。胶原生成的失调会导致纤维化（过多的胶原）或骨关节炎（过少的胶原）等病理变化。

因此，在许多情况下，胶原蛋白的测定是很重要的

疾病相关研究。

quickzyme总胶原测定是基于羟脯氨酸的检测。羟脯氨酸是一种非蛋白性氨基酸，存在于哺乳动物的弹性蛋白和胶原蛋白中。它的存在主要局限于胶原的三螺旋，在那里它的存在增加了三螺旋的稳定性。羟脯氨酸是在脯氨酸羟化酶的作用下由特定的脯氨酸残基翻译后形成的。组织水解物中的羟脯氨酸可以直接测量胶原蛋白的含量。

胶原的测定是从组织样品在95oC的6M HCl中*水解开始的。水解产物中的羟脯氨酸残基通过对prockop和udenfriend（anal）所述方法的改进进行定量。Biochem.，1960，1:228-239）。该分析测量了样品中羟脯氨酸的总量，它代表了样品中存在的所有类型的胶原，而不区分胶原类型和前胶原、成熟胶原和胶原降解。

产品

该测定是简单的，并且结果在570 nm处具有大的吸光度。这种分析方法的发展使得它不需要酸水解后的干燥步骤，而酸水解通常需要特殊的设备。

Total Collagen Assay

总胶原测定

总胶原蛋白测定试剂盒基于对胶原蛋白进行酸水解而获得的羟脯氨酸残留的定量比色测定。通常，对于该分析，需要水解除去HCl，这是一个耗时的步骤，并且/或者需要特殊的设备。QuickZyme总胶原蛋白测定法是仅有不需要此繁琐步骤的基于羟脯氨酸的测定法，可在水解步骤后进行快速（<2小时）且简便（96孔板形式）的测定。

胶原蛋白测定总规格

• 定量测量所有类型的胶原蛋白，种类无关。
• 样品：细胞提取物，组织匀浆，组织。
• 比色法测定羟脯氨酸含量
• 范围：6至300μg/ ml。灵敏度：2.5 µg / ml
• 以鼠尾胶原蛋白为标准
• 易用性：相当于ELISA
• 室温保存

价格/产品编号-订单

各种胶原的定量测定

•与物种无关

•570 nm下的比色读出

•快速简便

•动态范围广

•基于羟脯氨酸的分析

•独立于提取方法

•无需特殊设备！

分析规格

动态范围：6-300微克/毫升

灵敏度：2.5微克/毫升

样品体积：50-500微升

格式：96孔板

用途：非常广泛的应用：条件培养基

细胞/细胞提取物组织/组织提取物物种无关胶原类型无关

盒子里有什么？

包括标准、缓冲器和板。水解管，微量板，胶原蛋白标准品，缓冲液，检测试剂，板封。不包括盐酸。

其他所需材料

需要但不提供以下材料和设备：

•12M和6M HCl用于样品水解

•4M HCl用于样品和标准稀释

•单通道和/或多通道移液管

•Eppendorf离心机

•恒温箱（或温度计或校准烤箱），用于在95摄氏度（不高于！）

•在60℃下加热的培养箱

•可在540至580纳米之间测量波长的微板阅读器，优选570纳米。

•微孔板振动筛

•聚丙烯、聚乙烯或玻璃管（不含聚苯乙烯）

定量测量

储存条件

未打开的工具包：

在黑暗中室温（RT）下储存。不要使用超过套件有效期的套件组件。

打开的试剂盒/重组试剂：

打开的胶原蛋白标准品和分析缓冲液应在4℃下避光保存。其他打开的试剂应在室温下避光保存，并至少稳定1个月。重组检测试剂（A+B）应在重组当天使用。

预防措施

该试剂盒含有正丙醇、高氯酸、乙酸和二甲基亚砜。请参阅相关的MSDS:www.quickzyme。。ｃｏｍ/products/total-collagenassay。在2019年1月4日样品水解和使用试剂盒时，在总胶原蛋白分析期间佩戴眼睛、手、脸和衣物保护装置。在通风柜中进行分析。

临界参数

•此类分析可显示基质效应：样品中影响信号的干扰因素。通过稀释水解液可以避免这种影响。如果使用样品类型，应测试各种稀释液，直到获得A570与稀释液的线性。应用说明中给出了几种小鼠组织的建议稀释液（见我们网站上的产品页）。如果对于您的特定样品类型，为避免基质效应所需的稀释导致A570值非常低，我们建议使用

Quickzyme敏感组织胶原试剂盒。

•水解发生在95摄氏度（不高于！）20小时。螺丝帽

管子应该用手紧紧地关上。如果管不严密，水解液将蒸发。

•在分析的后一步中，在60℃下显色的培养时间为1小时。这是基于在烤箱中孵化。当在平板培养箱中进行培养时（培养箱和平板之间紧密接触），缩短的培养时间（20-30分钟）就足够了。

•当将分析缓冲液添加到35μl（稀释）水解液中时，会出现浑浊的外观，在一分钟内消失，不会影响分析。

•在低温下，分析缓冲液可能含有一些晶体。这些可以通过加热溶解。

在室温下，试剂A可能变成凝胶或固体，在37℃加热，涡旋将解决这个问题。

缓冲液/试剂制备

•分析缓冲液已准备好使用

•用于制备检测试剂混合物2体积的检测试剂A和3体积的检测试剂B。

检测试剂B和浓缩试剂A+B可能会腐蚀某些类型的塑料。对于这些溶液的移液，使用聚丙烯或聚乙烯移液管，或玻璃移液管。A+B溶液应在PP、PE或玻璃管中制成。不建议使用聚苯乙烯或PET。

试剂盒中提供的96孔板对分析中存在的稀释A+B溶液具有抗性。检测试剂B和A+B混合物具有腐蚀性，应小心处理。在通风柜中工作，使用适当的眼睛和面部保护，并戴手套。

样品制备（1）

-细胞提取物

将细胞提取物（50–250μl）转移到螺旋盖管中，并用12M HCl（终浓度6M HCl）以1:1（v/v）稀释。建议至少使用50μl样品和50μl 12M HCl。在放入烤箱之前，请将管子关紧。另请参见上面的关键参数。

-组织

a.组织匀浆

组织匀浆的处理与上述条件培养基和细胞提取物的处理类似。

b.组织样本

对组织样品（湿的或干的）进行称重，并将其转移到螺旋盖管中。所需的组织数量高度依赖于组织中的胶原蛋白水平。作为指示，根据组织的类型和数量，添加6M HCl以获得50-300 mg组织/ml。建议小体积为100μl。

样品制备（2）

管子必须非常紧密地闭合（从上面可以很清楚地看到橡胶圈），并在95℃下在校准的烤箱或热块中孵育20小时（不要在更高的温度下孵育）。孵育后，将试管冷却至室温。在达到室温之前不要打开管子。试管在eppendorf离心机中以13000 x g离心10分钟。上清液用于进一步分析。由于脂肪和碳水化合物的降解而产生的棕色或黑色颗粒可能存在，通过离心很难*去除。颗粒的数量取决于样品。转移上清液时尽量避免用移液管移取颗粒。除了挡住光路之外，这些微粒不会干扰分析。

首先用半水稀释水解样品：1体积样品+0.5体积水（例如200微升水解物+100微升水）。样品现在在4M HCl中。可能需要的所有进一步稀释（见“关键参数”中的备注）应使用4M HCl进行。试验中使用35μl稀释水解样品进行分析。

标准制备

胶原蛋白标准品以1200μg/ml的储备量在0.02m醋酸中提供。

对于标准线，将本标准的125μl转移到螺旋盖管中，并与等量（125μl）的12M HCl（6M HCl中的终浓度为600μg/ml）混合。管子非常紧密地闭合（橡胶圈应清晰可见），并在95摄氏度（不高于）下孵育20小时。在经过校准的烤箱或温度计中。孵育后，将试管冷却至室温，并在13000 x g的eppendorf离心机中离心10分钟。

上清液用于进一步分析。将8个Eppendorf管标记为S1-S8。s1至s7为水解料的稀释液，s8为空白。用水和4M HCl进行首轮稀释，以调整至4M HCl浓度。根据以下方案，在4M HCl中进行进一步稀释。结果得到如下标准线：300μg/ml（s1）；200μg/ml（s2）；100μg/ml（s3）；50μg/ml（s4）；25μg/ml（s5）；12.5μg/ml（s6）；6.25μg/ml（s7）；0μg/ml（s8）。稀释后将所有标准品充分混合。每种标准品35μl用于分析

胶原蛋白标准线样品制备的移液方案

分析程序

建议对所有样品和标准品进行分析，一式两份

一。按照“样品制备”中的说明制备样品。

2.按照“标准制备”中的说明制备胶原蛋白标准品。

三。用移液管将35微升标准溶液移到分析微孔板的适当孔中。

四。用移液管将35μl稀释的水解未知样品（在4M HCl中）移到适当的孔中。

5个。每孔加入75μl试液，混匀。

6.用一个封闭的胶粘板封条盖住板，在室温下孵育20分钟，同时摇动板。

7。通过检测试剂A和B2:3（RESP 30μL＋45 L L/阱）混合，制备一套足以检测待测威尔斯（75μL/阱）的试剂。

8。小心地拆下板密封件

9。每口井加入75μl检测试剂。

10。用封闭的粘合板密封件盖住板。

11。摇动盘子使之充分混合。在60°C的烘箱中培养60分钟（不要使用更高或更低的温度）。

12。把盘子放在冰上冷却5分钟至室温

13。混合板并小心地拆下板密封件

14。清洁板底部，在570 nm（可接受540-580 nm）下读取板并进行数据分析。

数据分析

有几种方法可用于计算分析样品中的胶原蛋白浓度。建议使用回归曲线拟合程序的软件包处理数据。如果不可用，可以手动计算胶原蛋白浓度，如下所示。

-平均每个标准品或样品的重复读数，并从所有读数中减去平均空白。

-通过绘制Y轴上的每个标准的A570（减去空白）与XXAX（0 – 3.13 – 6.25 – 12.5 – 25 – 50 – 100 – 200 – 300μg胶原蛋白/ml水解物）上的胶原含量的标准曲线。通过图形上的点绘制宜拟合线性化曲线。使用此标准曲线将试验样品的A570值转换为μg/ml胶原。这就得到了水解样品中的胶原蛋白浓度。如果水解后包括稀释步骤，则浓度应乘以2019年1月8日的稀释总胶原蛋白含量因子，得出水解样品中的胶原蛋白浓度。根据样品制备，可以计算原始样品中的胶原蛋白量。

典型数据

所示数据曲线仅供演示。准确的a570值在每个实验中可能略有不同。

典型的胶原蛋白标准曲线

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