特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

ER-Protein Capture Kit

ER-Protein Capture kit是一款利用荧光标记物特异性标记ER驻留蛋白，再使用标签捕获抗体通过免疫沉淀法纯化标记蛋白的试剂盒。可用于ER相关蛋白的全面鉴定与定量分析有或无刺激（例如内质网应激）下靶蛋白的ER驻留量。

※　本产品是funakoshi基于京都大学工学研究科浜地格教授、田村朋则讲师的研究成果商品化销售的产品。

※　本产品仅供研究使用。研究以外不可使用。

◆ER蛋白的回收方法与问题点

ER （内质网；Endoplasmic Reticulum）是一种通常在细胞内占据约20%体积的细胞器，结构非常复杂且遍布整个细胞。ER是负责细胞内蛋白质生物合成的中央细胞器，在多肽链合成、通过伴侣蛋白适当折叠、排除异常蛋白等，从生物合成到品质管理中起着重要作用。ER还担任分泌路径的一部分，是细胞膜蛋白和细胞外分泌蛋白通过的细胞器。另外，它还被认为对于脂质代谢和脂肪滴形成十分重要，因此能够分离、鉴定并定量分析ER蛋白的方法备受期待。然而，不同于其他细胞器，特异性纯化ER的的技术十分贫乏，选择性回收ER蛋白并不容易。

ER Protein Capture Kit是由京都大学浜地格教授、田村朋则讲师等开发的基于ER驻留蛋白标记技术商品化的ER蛋白选择性标记、纯化试剂盒。通过使用ER驻留蛋白标记试剂ERM （ER-localizable Reactive Molecule），可以利用荧光标记物标记ER驻留蛋白，然后通过针对该标记物的特异性抗体进行纯化，选择性回收ER蛋白。无需超速离心机等特殊的机器，仅需简单操作便可纯化ER蛋白。除了能够通过蛋白组学进行全面鉴定外，本产品还适用于相对定量分析各种刺激处理下的ER驻留量。

◆试剂盒内容

本试剂盒由两部分组成。

A：ER驻留蛋白标记试剂ERM

A：（本试剂与产品名称为ERseeing、产品编号FDV-0038为同一试剂。可单独购买，也可以用作ER成像试剂）

B：标签捕获抗体（纯化兔多克隆IgG抗体）

A：※ 产品不包含用于细胞裂解液制备用的溶解缓冲液或免疫沉淀所需的Protein A / G树脂等。请另行购买。

◆原理和实验流程

ER驻留蛋白标记试剂ERM是一种在ER驻留性绿色荧光色素（Rhodol衍生物）上缀合蛋白标记基团的化合物。将ERM添加到活细胞后，由于色素部分的特性，显示出较高的ER驻留性。在ER中迅速浓缩后，通过蛋白标记基团用荧光标记物标记ER蛋白物（Step-1）。标记反应后破碎细胞制备细胞裂解液（Step-2），然后通过使用标签捕获抗体（抗Rhodol抗体）进行免疫沉淀（Step-3），可以选择性地回收被ERM标记的ER蛋白。由于回收的蛋白上带有荧光基团，使用SDS-PAGE分离后，可以通过CBB/银染或荧光成像仪检测出来（Step-4）。进行SDS-PAGE分离后，可以通过LC / MS进行全面蛋白组学分析或使用任何抗体的蛋白印迹法鉴定ER蛋白。

◆原著论文

Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc., 140, 17060～17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.

◆实验参考数据

■ ERM的激发/发射光谱

■ 激发光谱（蓝）以及发射光谱（绿）

■ ※ 适用于普通的绿色荧光色素FITC观察条件

■ ER特异性检验

■ 通过与各种细胞器标记共染色评价本试剂的ER特异性。观察到ERM（100 nM）与ER标记试剂高度共定位（皮尔逊相关系数>0.9）。另一方面，未观察到本试剂与溶酶体标记、线粒体标记的共定位。高尔基体标记观察到部分共定位，应该是因为本试剂所标记的蛋白通过Golgi体运输从ER转移至分泌路径。此外，添加ER-Golgi运输抑制剂的话，会减少与高尔基体的共定位（详细请参考原著论文）。

◆应用实例

通过蛋白组学全面分析回收蛋白

使用ERM (100 nM)处理HeLa细胞后，破碎细胞制备细胞裂解液。在裂解液中加入标签捕获抗体，使用Protein A磁珠进行免疫沉淀回收标记蛋白。将回收的蛋白通过SDS-PAGE分离后，切出每个条带，在凝胶中用胰蛋白酶/ Lys-C消化制备LC/MS样品。通过MS分析鉴定出共146种蛋白，其中63种蛋白是数据库上的ER蛋白，或是个别论文中确认了ER驻留的蛋白。73种蛋白作为细胞膜、细胞外分泌蛋白以及高尔基体蛋白被鉴定出来，它们都是存在于细胞外分泌路径的蛋白。由于存在于细胞外分泌途径的蛋白会途经ER，当这些蛋白在ER的时候便会被标记。因此，检测出来的蛋白中ER蛋白与途经ER的蛋白约占93%。本实验中检测出与ER无关的蛋白有10种，约占7%。

R应激引起的ER驻留蛋白变动量的定量评价

通过SILAC定量分析法分析ER应激诱导的ER驻留蛋白的变动量。准备两份细胞，一份在SILAC Heavy标记培养基中培养，另一份在Light标记培养基中培养。在Heavy标记培养基的细胞中添加ER应激诱导试剂Tunicamycin培养4 h。而Light标记培养基无需任何处理培养4 h。之后，使用ERM（100 nM）处理1 h，分别制备细胞裂解液，再以1:1的比例混合。通过免疫沉淀法回收混合裂解液中的标记蛋白，然后与上述实验一样，制备LC/MS用样品。检测出了87种可相对定量的蛋白，再通过SILAC法算出由ER应激引起的变动量。其中6种蛋白因ER应激在ER上的存在量增加了两倍以上。

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。

ERseeing ＜Endoplasmic Reticulum Green＞

对活细胞影响少，适用于长时间成像的ER染色试剂

本产品是活细胞成像用的不可逆ER染色试剂。与传统的荧光标记 Glibenclamide系ER染色试剂相比，对细胞功能的药理作用小，由于其不可逆性，更换培养基后也可进行观察。

※ 本产品是 funakoshi 基于京都大学工学研究科浜地格教授·田村朋则讲师的研究成果商品化的产品。

※ 本产品仅供研究使用。

◆现有 ER 染色试剂的问题点以及 ERseeing 的优势

过去通用的 ER 染色试剂是将荧光染料附着于在ER中特异表达的 K⁺ 通道拮抗剂 Glibenclamide 上，并广泛用于 ER 的可视化。然而，由于以下的问题，应用范围有限。

●  由于 Glibenclamide 的药理效果，通道活性被抑制，对细胞的影响大。

●  由于是可逆的拮抗剂，因此通过培养基交换等的清洗操作非常容易去除。

与之相对的，ERseeing 是一种新型ER染色试剂，具有与Rhodol绿色荧光染料相连的蛋白标记基团，对 ER 膜成分具有很高的亲和力。通过选择性地集中在 ER 上并用荧光基团标记 ER 蛋白，可以进行不可逆的染色。由于是不可逆的染色，染色后可更换含有 FBS 的培养基，因此可应用于任何的培养基和试剂处理环境下的长期成像。

◆原著论文

Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc., 140, 17060～17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.

◆特点

●  激发/荧光波长：509 nm/524 nm

    ※  可利用一般的绿色色素FTIC的观察条件

●  与传统的荧光标记 Glibenclamide 系染色试剂相比，可以很好地抑制对细胞的影响。

●  即使培养基中含有 ERseeing 也可以进行观察。

    ※  如果在培养基中长时间染色的话，或许会出现色素呈油滴状聚集等非特异性染色的情况。若想提高特异性，建议清洗后再观察。

●  由于是不可逆性染色，染色后可更换培养基。染色后可在含有FBS培养基等的任意培养基中成像。

●  活细胞染色后，也可固定后观察。还可以与免疫染色法组合使用。

    ※  本试剂不适用于固定后细胞的染色。染色请使用活细胞。

◆应用实例

■  ERM的激发·荧光光谱

激发光谱（蓝）和荧光光谱（绿）

※  适用于一般绿色荧光色素 FTIC 观察条件

■  验证 ER 特异性

通过与各种细胞器标记共染色评价本试剂的ER特异性。观察到 ERseeing（100 nM）与现有的 Glibenclamide 系 ER 染色试剂高度共定位（Pearson 相关系数 > 0.9）。另一方面，未观察到与溶酶体标记和线粒体标记的共定位。高尔基体标记观察到部分共定位，可能是本试剂标记的蛋白通过高尔基体转运，从 ER 转移至分泌途径。然而，添加 ER-Golgi 转运抑制剂的话会减少与高尔基体的共定位。（详情请参考原著论文）

■  评价细胞内滞留性

向无血清培养基培养的HeLa细胞内添加 ERseeing 以及传统的荧光标记 Glibenclamide，染色15 min 后进行观察（左）。然后，更换含有10%FBS的培养基再次观察。荧光标记 Glibenclamide 在清洗后荧光信号明显消失了，但是由于 ERseeing 是不可逆染色的，清洗后也能观察到很强的荧光信号。使用 ERseeing 进行 ER 染色后，可以在含 FBS 的培养基中培养并进行各种成像。