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PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay

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PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测
PROTEOSTAT® Protein aggregation assay

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PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assayPROTEOSTAT® 蛋白聚集检测

　　某些肽链在经过错误折叠后很容易形成聚集，在生物技术和制药领域，这些聚集会严重影响蛋白的生产和应用。许多以蛋白多肽为基础研发的药物具有极大的应用前景，可是蛋白因错误折叠而导致构象发生变化形成聚集，使蛋白失活，最终影响药物疗效，造成不可估计的损失。污染物导致的蛋白聚集包括宿主细胞蛋白、非蛋白微粒和蛋白的损伤形式。

　　基于此 Enzo Life Sciences 推出了新产品 PROTEOSTAT® Protein Aggregation Assay，内含红色荧光信号染料，可特异性结合聚集蛋白，进行检测。具有广泛的检测范围，可有效检测可见和不可见的蛋白微粒。



 ◆原理

　　蛋白聚集严重影响以蛋白为基础研发的药物。在药物制剂中，蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影响药效。

　　蛋白聚集发生在生产过程的各个阶段包括细胞培养、纯化、生产、储存、运输等方面。制药工业希望在生物工艺中找到新的方法，可用于检测、追踪、定量分析影响蛋白聚集的因素。

　　近年来以冻干稳定形式存在的蛋白聚集体作为标准品，可以准确地定量检测蛋白聚集，加上新颖的只需在酶标仪里即可实验的 PROTEOSTAT® protein aggregation assay，可对蛋白检测方法进行优化。

　　在这篇文章中，使用已知浓度的聚集 IgG 标准品作为标准曲线，通过 PROTEOSTAT® protein aggregation assay/standards 对 IgG 的聚集水平进行检测，集中分析了制药工业中常见的３种聚集形式。

　　●    热诱导聚集

　　●    机械诱导聚集

　　●    冷冻和反复冻融诱导聚集


PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay

◆优点・特色


　●　高通量筛选方法用于流式细胞仪平台监测蛋白稳定性

　●　在荧光微孔板中即可进行简单、灵敏、均一地检测

　●　不需分离目的蛋白或稀释样品

　●　与传统蛋白聚集检测染料相比更灵敏，信号更明亮

　●　优化的缓冲液和辅料用于蛋白制剂研发

　●　检测灵敏度可低至亚微摩尔级别，含量在１%-５%的聚集蛋白也能被检测出

　●　在广泛的 PH（4-10）和离子强度范围都可使用，提供至少两个数量级的线性动态范围

　●　使用 PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测标准品可对溶液中的聚集蛋白精确定量

　●　可检测蛋白多肽聚集程度，可用于筛选蛋白聚集激活剂或抑制剂


在蛋白聚集实验研究中，将 PROTEOSTAT® protein aggregation assay 和 Synergy Mx Multi-Mode Microplate reader 联用，可适合用于监测由温度、机械损伤和反复冻融所引起的蛋白聚集。

稳定的蛋白颗粒作为标准品可快速建立标准曲线，加快定量分析蛋白聚集响应。这个检测方法能够可靠地检测到浓缩抗体制剂中小于 0.2% 的聚集蛋白，线性动态范围为２个数量级。

PROTEOSTAT® protein aggregation assay 和 PROTEOSTAT® protein aggregation standards 检测蛋白聚集特点在于操作简单，能够检测低水平的蛋白聚集情况，只需 30 分钟，就能够得到完整的分析结果。


案例一


PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay


不同搅拌速率对蛋白聚集的影响

案例二


PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay


蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集

使用本产品检测后，可知搅拌速度越快，蛋白聚集程度越大。

蓝色曲线为对照，没有搅拌速度在 300 rpm 下，绿色曲线与红色曲线分别表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情况与天然蛋白的聚集情况。使用本产品检测后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。

使用流式细胞仪结合PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒使用例
PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay


A PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品 B PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测硅油滴 C PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品和硅油滴的混合物。

使用流式细胞仪结合 PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品，可与其他非蛋白微粒如油滴区别开来，且无须考虑样品微粒大小（经检测 >97% 的 IgG 聚集标准品都小于２μm）。

案例・应用

材料和方法

　　

Enzo Life Sciences 推出了 PROTEOSTAT® protein aggregation assay 和 PROTEOSTAT® protein aggregation standards，利用荧光分子信号染料可特异性结合聚集蛋白和多肽，在微孔板中即可检测。

探针在溶液中是不发出荧光的，当与聚集蛋白的四级结构结合时会发出明亮的荧光。一旦聚集标准品发生重组，它们将含有０-12.5% 的聚集蛋白，总蛋白浓度维持在１mg/mL。

通过粒子分析成像鉴定标准品发现90%的蛋白聚集体长度为２-10 μm，约9%的蛋白聚集体长度为 10-20 μm，约 0.7% 的蛋白聚集体为长度大于 20 μm。

Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader（BioTek Instruments）可用于所有蛋白聚集分析。它的激发波长为 500 nm，发射波长为 600 nm，激发和发射狭缝宽度为 9 nm，便于检测 PROTEOSTAT® 染料。Thioflavin T 染料可以在激发单色器激发波长为 435 nm，发射波长为 495 nm，都在激发和发射狭缝宽度为 9 nm 的条件下进行检测。

 


结果


在 96 孔微板中检测比较 PROTEOSTAT® 和 Thioflavin T 染料与蛋白聚集的结合能力。纯化的兔抗羊 lgG（4.26 mg/mL）在 pH 2.7 的盐酸水溶液中，80℃ 温度下孵育 90 分钟后会形成蛋白聚集体。

聚集信号由聚合体和单体混合比例不同决定的，但总的 lgG 蛋白浓度仍然是 60 μg/mL。在 50 mM 磷酸钾，pH 7，3 μM ProteoStat 检测试剂或 5 μM Thioflavin T 染料中读数。这些浓度在以前做过预实验，已经确定是最优的浓度。

在蛋白和染料一起孵育 15 分钟后使用 BioTek Synergy Mx Microplate Reader 读数。所用的板为 Greiner µClear® black，clear bottom 96-well microplates (Greiner Bio One)。

在相同情况下，PROTEOSTAT® 染料的荧光强度比 Thioflavin T 染料高 100 倍。对于浓度为 1.2 μg/mL的聚集体，ProteoStat 染料的信噪比为 12.8，而 Thioflavin T 染料的信噪比仅为 1.2，表明 PROTEOSTAT® 染料在蛋白聚集检测中更准确、灵敏度更高。

正因为由此显著的优势，PROTEOSTAT® protein aggregation assay 和 ProteoStat protein aggregation standards 通常能够共同用于各种常规形式的蛋白聚集检测。

 


监控热诱导聚集


当蛋白受到提高温度刺激会加速其聚集。羊 lgG（4 mg/mL）在各个时期都处于搅拌速度 400 rmp，100 mM 磷酸钠，pH 7.2，温度 60℃ 下。

在每个时间点，25 μL lgG 用于测量。首先样本在 1× assay buffer 中稀释４倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL 。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。

同时，PROTEOSTAT® protein aggregation standards 中含有稳定的、高质量的对照样本，用来做标准曲线。

如图１所示，使用 PROTEOSTAT® 染料检测羊 lgG 在热诱导下的聚集情况，生成的曲线表明不同阶段 lgG 蛋白聚集的情况。

在刚开始阶段蛋白聚集情况较少，接着观察到生长阶段聚集体开始形成，最后生长率降低直至变成０，表明蛋白单体已几乎消失，差不多完全形成聚集体。


PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay

图1：热诱导羊 IgG 蛋白聚集

 


监控机械诱导聚集


虽然普遍认为机械搅拌会加速蛋白聚集形成，但目前机械外力造成蛋白聚集形成的原理还不是十分明确。在药物研发中，可能受到抽真空或者过滤等产生的机械外力使蛋白药物形成聚集。

羊抗鼠 lgG（10 mg/mL）溶解在含有 10 mM 的磷酸钠，150 mM Nacl，0.05% 叠氮化钠，pH 7.2 的溶液中。机械搅拌的实验条件如下：室温、4 mL 的平底褐色玻璃瓶中加入 200 μL lgG 溶液，使用 Variomag® Poly electronic stirrer（2Mag-USA），以 990 rpm 速度进行搅拌。搅拌棒体积为1.0×0.4×0.2 cm3。

在每个时间点，取10 μL lgG 用于检测。样品在 1×assay buffer 中稀释 10 倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。

用 PROTEOSTAT® protein aggregation standards 作为标准曲线，定量检测机械搅拌诱导产生的蛋白聚集。在上述实验条件下，蛋白聚集与时间成正比例关系（图２）。


PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay

图2：机械诱导样抗鼠 IgG 蛋白聚集

 


监控冷冻和反复冻融诱导聚集


冷冻对于蛋白稳定是至关重要的，因为在冷冻过程中会导致溶液的浓度发生变化。羊抗鼠 lgG（10 mg/mL）溶解在 10mM 的磷酸钠，150 mM Nacl，0.05% 叠氮化钠，pH 7.2 的溶液中。样品保存在 -20℃，反复冻融数次。

在每个时间点，取10 μL lgG 用于检测。样品在 1×assay buffer 中稀释 10 倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点做平行孔。

用 PROTEOSTAT® protein aggregation standards 作标准曲线，定量检测反复冻融诱导产生的蛋白聚集体。实验表明反复冻融也会诱导产生蛋白聚集。与热诱导引起蛋白聚集一样，会观察到一条Ｓ型曲线图。


PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay

产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
ENZ-51023-KP050 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay
 PROTEOSTAT ®  蛋白聚集检测		 50 tests – –
ENZ-51023-KP002 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay 2×96 tests – –

PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit 加速蛋白稳定性筛选

发表于由

PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit
加速蛋白稳定性筛选

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PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit 加速蛋白稳定性筛选

PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit

加速蛋白稳定性筛选

●　简单、灵敏、均相的荧光检测，无需分离或稀释样品

●　可用于加速优化蛋白稳定性条件

●　无需了解蛋白功能或配体结合位点，也可进行配体结合检测

●　可在较广的温度、pH值和离子强度范围内使用，与常用的缓冲液和辅料兼容

●　为采用多种仪器进行交叉验证提供一种方便、互补的正交方法

 

PROTEOSTAT® Thermal shift 稳定性检测试剂盒内含有一种检测蛋白聚集的荧光染料，因此可用于监测系统热应力条件下的蛋白稳定性。通过 Thermal shift 分析，可轻松确定大部分蛋白的聚集温度。聚集温度是蛋白稳定性的指标，可用于优化使蛋白聚集最小化的条件，以及鉴定与目标蛋白结合并赋予结构稳定性的配体。配合使用相关的 PROTEOSTAT® 蛋白复性和聚集敏感试剂盒（产品编号：ENZ-51040）可确定合适的蛋白复性条件。增加聚集温度的优化条件可使蛋白的稳定性有所提升。

PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit 加速蛋白稳定性筛选

图1. 利用PROTEOSTAT® Thermal shift 稳定性检测试剂盒分析山羊抗小鼠 IgG（pH=7.4，11.2 mg/mL）的典型结果。

图1. 使用 RT-PCR 仪器，以 3°C/min 的速率将温度从30°C升至99°C，同时连续读取荧光值。蓝线表示原始荧光强度数据，红线表示对应的一阶导

图1. 数曲线，代表荧光强度曲线的斜率。通过一阶导数图，可得出蛋白的聚集温度（Tagg：斜率最大点）。

PROTEOSTAT® 染料的 Tagg 值不同于 SYPRO® Orange 染料的 Tm 值

PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit 加速蛋白稳定性筛选

图2. PROTEOSTAT® 染料所得得聚集温度不同于使用 SYPRO® Orange 染料获得的熔解温度。

图2. SYPRO® Orange 染料是一种环境敏感染料，能够与未折叠蛋白的疏水区结合，用于测量 Tm。Tm 是 Thermal shift 曲线的温度中点，在温度

图2. 中点 Tm 时，样品中的目标蛋白一半呈现出解折叠状态，而另一半保持折叠状态。解折叠不依赖于相邻蛋白。PROTEOSTAT 是一种分子转子染

图2. 料，可与蛋白质聚集体的表面结合。Tagg 是热聚集曲线的中点。蛋白解折叠后开始聚集，聚集取决于相邻蛋白。蛋白浓度越高，聚集的趋势越

图2. 大。

◆产品详情

特点

本试剂盒用于监测系统热应力条件下的蛋白稳定性。

品质保证

每批次 PROTEOSTAT®Thermal shift 稳定性检测试剂盒的样品试剂盒均已按照操作手册中的步骤进行测试。

16 μg/ml β-乳球蛋白的聚集温度单峰位于76°±2°C处。

使用/稳定性

在产品标签注明的日期前，试剂盒组分在适当的储存条件下可稳定保存。

可存放于-20°C的无霜冰箱中。

储存条件

避光。避免反复冻融。

运输方式

干冰运输

储存温度

-20°C

组分

· PROTEOSTAT® TS 检测试剂

· β-乳球蛋白对照

· 10X 检测缓冲液

技术信息/产品说明

应用说明：

Prediction of Aggregation Propensity   and Monitoring of Aggregation of Antibody-Drug Conjugates (ADC) using   ProteoStat® Reagents

检测样本：

PROTEOSTAT® Cited Samples

 

Enzo及PROTEOSTAT均为Enzo Life Sciences, Inc. 的商标。Grenier为Grenier Bio-One 的注册商标。Enzo的部分产品和产品应用受美国、外国专利以及正在申请的专利的保护。本产品由ENZO LIFE SCIENCES, INC. 制造和销售，仅供研究市场的终端用户作研究使用，不得用于诊断或治疗用途。购买行为不包括在商业上使用、开发或以其他方式利用本产品的任何权利或许可。未经ENZO LIFE SCIENCES, INC. 事先明确书面授权，严禁对本产品进行任何商业用途、开发或利用，或使用本产品进行研发。

监管状态

RUO – 仅供研究使用

◆产品列表

产品编号

产品名称

包装

ENZ-51027-K400

PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit
PROTEOSTAT® 热稳定检测试剂盒

400 tests

ENZ-51027-K100

100 tests


产品参考文献

1.

Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system: S. Murakami, et al.; Sci. Rep. 9, 671 (2019), Application(s): Purified IgG or Trastuzumab, 摘要; 全文

2.

Structural insights into humanization of anti-tissue factor antibody 10H10: A. Teplyakov, et al.; MAbs. 10, 269 (2018), Application(s): Monoclonal antibodies, 摘要; 全文

3.

Protein catalyzed capture agents with tailored performance for in vitro and in vivo applications: M.B. Coppock, et al.; Biopolymers 108, e22934 (2017), Application(s): Stability of peptide-based ligands, 摘要;

4.

Time-Dependent Protein Thermostability Assay: I. Vandecaetsbeek, et al.; Methods Mol. Biol. 1377, 79 (2016), 摘要;

5.

Effect of Polyethylene Glycol Conjugation on Conformational and Colloidal Stability of a Monoclonal Antibody Antigen-Binding Fragment (Fab'): C. Roque, et al.; Mol. Pharm. 12, 562 (2015), 摘要;

6.

Modulating the thermostability of Endoglucanase I from Trichoderma reesei using computational approaches: G. Bayram Akcapinar, et al.; Protein Eng. Des. Sel. 28, 127 (2015), 摘要;

7.

Site-specific conjugation of monomethyl auristatin E to anti-CD30 antibodies improves their pharmacokinetics and therapeutic index in rodent models: F. Lhospice, et al.; Mol. Pharm. 12, 1863 (2015), 摘要;

8.

A general approach to antibody thermostabilization: A.D. McConnell, et al.; MAbs 6, 1274 (2014), Application(s): Stability of antibodies, 摘要; 全文

9.

Modifications of cysteine residues in the transmembrane and cytoplasmic domains of a recombinant hemagglutinin protein prevents cross-linked multimer formation and potency loss: K.M. Holtz, et al.; BMC Biotechnol. 14, 111 (2014), 摘要;

10.

An integrated approach to extreme thermostabilization and affinity maturation of an antibody: A.D. McConnell, et al.; Protein Eng. Des. Sel. 26, 151 (2013), 摘要;

11.

Mouse, but not human STING, binds and signals in response to the vascular disrupting agent 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid: J. Conlon, et al.; J. Immunol. 190, 5216 (2013), 摘要;

12.

Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens: S. Boivin, et al.; Protein Expr. Purif. 91, 192 (2013), (Review), 摘要;

13.

Protein quality control acts on folding intermediates to shape the effects of mutations on organismal fitness: S. Bershtein, et al.; Mol. Cell 49, 133 (2013), Application(s): Aggregation propensity of the DHFR proteins, 摘要;


其他参考文献

1.

Estimation of protein aggregation propensity with a melting point apparatus: A.A. Raibekas; Anal. Biochem. 380, 331 (2008), 摘要;

2.

Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies: U.B. Ericsson, et al.; Anal. Biochem. 357, 289 (2006), 摘要;

3.

Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils: R. Nelson, et al.; Nature 435, 773 (2005), 摘要;

4.

Study of the thermal denaturation of ribonuclease A by differential thermal analysis and susceptibility to proteolysis: B.G. Winchester, et al.; Biochem J. 117, 299 (1970), 摘要;

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

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PROTEOSTAT® Aggresome detection kit
蛋白聚集小体检测试剂盒

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蛋白聚集小体检测试剂盒PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit

 


◆原理


PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

聚集小体（Aggresome）是由一群不正常堆叠在一起的蛋白质所形成的包涵体（Inclusion Bodies）。聚集小体的出现往往也表明细胞正处于某种应激状态，比如高温、病毒感染、活性氧自由基攻击等。聚集体通常是响应细胞应激而形成，并通过分离错误折叠的蛋白质提供细胞保护机制，最终导致它们被自噬清除。此外，蛋白质聚集体的形成是多种人类疾病的标志，例如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症或酒精性肝病。

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit中包含的 PROTEOSTAT® 是一种分子转子染料，在溶液中沿着单个中心键的自由分子内旋转可防止荧光产生。当它特异地插入到错误折叠和聚集的蛋白中的交叉β-sheet四级结构中，旋转受到抑制并导致发出强烈的荧光。

PROTEOSTAT® 聚集小体检测试剂盒提供了一种快速、特异、定量的方法来标记细胞中的聚集小体，且无需进行人工蛋白定点突变。PROTEOSTAT® 染料已在广泛的条件下对多种小分子调节剂进行验证，适用于具有治疗价值的化学物的筛选。此外，本试剂盒还适用于多重免疫荧光，以在自噬和聚集体形成的背景下研究您的目标分子。

◆试剂盒组成

组分

包装

PROTEOSTAT® Aggresome Detection Reagent

10 μL

Hoechst 33342 Nuclear Stain

50 μL

Proteasome Inhibitor (MG-132)

120 nM

10×Assay Buffer

25 mL

 ◆特点


●　提供基于细胞的灵敏的药物反应性测定，以在真实的细胞环境中识别与神经退行性疾病相关的抑制剂

●　可靠且简单的检测，不需要非生理性蛋白质突变或基因工程细胞系

●　作用条件广泛，适用于筛选具有潜在治疗价值的小分子化合物

●　已进行优化以兼容免疫染色

●　可通过流式细胞术轻松量化聚集体和相关包涵体

●　可用于神经退行性疾病、肝病、毒理学研究等的研究 

 ◆案例・应用

 

■　应用实例 1：流式细胞术检测聚集小体

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

流式细胞术的分析：Jurkat细胞在37°C下用 0.2% DMSO对照或用5 µM MG-132诱导过夜。处理后，将细胞固定并与PROTEOSTAT® 染料一起孵育，无需洗涤即通过流式细胞术在FL3通道中使用488 nm激光进行分析。在 MG-132处理的细胞中，红色荧光信号增加约3倍。所描述的测定允许评估蛋白质聚集的影响。



■　应用实例 2：PROTEOSTAT® 染料与荧光染料的应用


PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒


荧光显微镜：含有蛋白聚集体的HeLa细胞，用 5 µM MG-132蛋白酶体抑制剂（右）处理12小时，通过 PROTEOSTAT®（红色）检测并用Hoechst 33342复染。左侧的为未经处理的对照。



PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒


荧光显微镜：含有蛋白聚集体的HeLa细胞，用 5μM MG-132蛋白酶体抑制剂处理12小时，通过PROTEOSTAT®　聚集体染料（左上）检测，显示与荧光素-p62抗体（右上）和复合图像（中下）的共定位



■　应用实例 3：不同搅拌速率对蛋白聚集的影响

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

使用本产品检测后，可知搅拌速度越快，蛋白聚集程度越大。

■　应用实例 4：蛋氨酸氧化可抑制蛋白聚集

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

蓝色曲线为对照，没有搅拌；在搅拌速度在300 rpm下， 绿色曲线与红色曲线分别表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情况。

使用本产品检测后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。

■　应用实例 5 ：内质网应激相关细胞自噬产生蛋白聚集小体

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

分别25，50，75 mmCQ，100 nM的thapsigargin（TG）或5mM的MG-132处理K562细胞24小时。然后在温室下用PROTEOSTAT® （1：10,000）固定并透化细胞30min。接着在BD流式细胞仪LSR II的蓝色610/20 nm的通道分析细胞（30,000）。

图片来源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.

■　应用实例 6

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

K562 细胞分别使用Thapsigargin (Tg, 0.1 µM)、25、50 和 75 µM 氯喹 (CQ) 用试剂处理以诱导内质网应激和不完全自噬 24 h。使用蛋白酶体抑制剂 MG-132 (5 µM) 作为阳性对照处理24 h。将沉淀的细胞固定并透化。然后，根据制造商的说明，使用 300 µL PROTEOSTAT® 和 1 µg/mL DAPI（用于细胞周期测定）在室温下标记细胞30min。确定每个处理的S期的 Aggresome 倾向因子 (APF) 高于G1和高于S期的G2m的相对增加，并与对照值进行比较。与对照组相比，ER 应激诱导剂、Tg 和 50 µM CQ在S期比G1更能引起蛋白聚集体上调，但蛋白酶体抑制剂 MG-132 和 50 µM CQ 在 G2m 期比S期更显著地下调聚集体。

图片来源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 蛋白聚集小体检测试剂盒

PROTEOSTAT® Aggresome Detection Kit

PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测试剂盒 Q&A


1．Q：　PROTEOSTAT® 热稳定检测试剂盒（ENZ-51027），蛋白聚集检测试剂盒（ENZ-51023）

1．Q：　和PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测试剂盒（ENZ-51035）的区别？

1．A：　1）PROTEOSTAT®染料属于分子轮子染料（molecular rotor dye）。在溶液状态不发荧光（由于在中心的碳-碳单键周围的自由转动，

                    分离了探针的不同芳香部分）。由于分子轮子染料接触到蛋白聚集体后，会封闭进入原纤维，形成β折叠，具有高强度荧光。类似于

                    染核酸碱基的EB 一样。

1．A：　2）PROTEOSTAT® 热稳定检测试剂盒（ENZ-51027）用于直接监测热诱导蛋白变性引起的蛋白聚集，不检测蛋白非折叠而暴露的疏

                    水部分。该试剂盒用于检测蛋白缓冲液，其他添加成分对蛋白稳定性的影响，在特定条件下多少温度时蛋白会聚集。

1．　A　3）蛋白聚集检测试剂盒（ENZ-51023）用于检测液体状蛋白或者多肽形成聚集的情况。可用于确认蛋白保存的最优形态，筛选促进或

                    者抑制蛋白聚集的试剂，检测分子伴侣的活性。与标准品或者已知浓度样品一起使用，可定量检测蛋白聚集。

1．　A　4）PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测试剂盒（ENZ-51035）检测变性蛋白，包括活细胞内聚集体或者聚集体样包涵体。PROTEOSTAT® 

                    蛋白聚集检测染料在聚集小体形成时，接触到聚集蛋白时会变的更明亮，可用流式或者荧光显微镜检测。


２．Q：　使用ENZ-51035 时，是否可以终止并在在40℃过夜保存，第二天继续实验？

　　A：　建议可以在加染料前终止。荧光强度在液体中会成倍降低。而且染料与蛋白长时间孵育后，会影响蛋白聚集。


３．Q：　阳性对照染色不好。

　　A：　染料没有避光保存。染色时候没有避光，需要染色后立即检测。聚集蛋白不是液体。延长离心会使聚集蛋白沉淀。不要离心聚集蛋

                白（样品或者对照）。


４．Q：　蛋白信号饱和。

　　A：　蛋白样品的浓度很高。用1×Assay Buffer 稀释样品。


５．Q：　阴性对照观察到高荧光强度。

　　A：　样品含有干扰物质。该试剂可以与常规使用的缓冲液(PBS,Tris,HEPES)和赋形剂（海藻糖和蔗糖）使用，不过不要使用高浓度的吐温 

                20（比如：0.2%）


６．Q：　蛋白与PROTEOSTAT® 检测试剂结合是否是可逆的？

　　A：　PROTEOSTAT® 检测试剂与聚集蛋白的相互作用是非供价结合。所以，理论上是可逆的。但是我们没有尝试将染料从样品中去除。


７．Q：　在药物应激检测中，细胞是否可以经胰酶消化后去检测细胞中的蛋白聚集？

　　A：　胰酶可以与PROTEOSTAT® 聚集检测试剂盒配套使用。细胞消化后，表面活性剂加入给细胞打孔。更大的聚集体仍然是不溶的，可

                以通过离心沉淀。小的聚集体通过超滤分离。表面活性剂，膜和可溶蛋白可洗掉，PROTEOSTAT® 检测试剂可用于残留蛋白。


８．Q：　在研究细胞蛋白聚集时，如何设置阳性对照？

　　A：　MG 132 处理的细胞可作为阳性对照。


９．Q：　细胞裂解液是否可用PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测试剂检测？

　　A：　检测细胞裂解液是有挑战的，表面活性剂会引起高背景。可以过滤去除表面活性剂。更大的聚集体仍然是不可溶的，可以通过

                离心沉淀。小的聚集体通过超滤分离。表面活性剂，膜和可溶蛋白可洗掉，PROTEOSTAT® 检测试剂可用于残留蛋白。


１０．Q：   PROTEOSTAT® 染料是否可以检测~300kDa 的蛋白二聚体？

　　　A：　PROTEOSTAT® 可以检测从单体到二聚体转变的蛋白，结合分子筛层析法。但是信号会变的更强烈，因为聚集体更大。


１１．Q：　如果样品稀释到低浓度（比如0.5mg/mL）是否会改变聚集蛋白的百分比含量？

　　　A：　聚集蛋白的百分比（聚集蛋白占总蛋白的比例）将保持不变。聚集蛋白的浓度会降低，信号也会减弱。

　　　A：　如果用未聚集蛋白稀释样品，聚体蛋白的百分比会变化。


１２．Q：　PROTEOSTAT® 试剂盒是否可用于研究原核细胞样品的蛋白聚集？

　　　A：　如果膜部分去除的话，是可以检测原核细胞的。如果膜没有分离，染料会聚集在膜上，引起高背景值。


１３．Q：　PROTEOSTAT® 是否可检测革兰氏阴性菌的蛋白聚集？

　　　A：　革兰氏阴性菌外层膜的脂多糖会影响。操作手册中提到的打孔缓冲液将移除大多数细菌的内层膜，破坏革兰氏阴性菌的外层膜。所以

                   可以观察革兰氏阴性菌的聚集和包涵体。


１４．Q：   当其他蛋白共染时，如何优化减少FITC 发射过滤装置的信号？

　　　A：　染料的激发和发射光谱见操作手册P8。光谱显示会与FITC 有些重叠。FITC 可以与该染料一起使用，用488nm激发波长和515nm 发

                   射波长。如果FITC 有荧光的话就会起作用。否则，PROTEOSTAT® 染料会有溢出。建立设立一个不带有FITC 标记的抗体作为对照。

                   另外，可用Cy5 或者Coumarin 标记的抗体解决这个问题。

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产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
ENZ-51035-K100 PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 
PROTEOSTAT®蛋白聚集小体检测试剂盒		 100 tests – –
ENZ-51035-0025 PROTEOSTAT® Aggresome detection kit 
PROTEOSTAT® 蛋白聚集小体检测试剂盒		 25 tests – –
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