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SphereOTM技术说明

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SphereOTM技术说明STN-21

SPHEROTM Technical Note STN-21 Rev A 050520

SPHEROTM STREPTAVIDIN PARTICLES USES AND PROTOCOLS

SPHEROTM链霉亲和素颗粒的用途和协议

链霉亲和素
链霉亲和素是一种蛋白质（分子量约66000），由四个相同的亚单位组成，每个亚单位都含有生物素的高亲和力结合位点（KD=10-15）
M） 。它与抗生物素蛋白具有相同的生物素结合特性，但观察到的非特异性结合较少。它已被用于免疫分析和基因组分析
用于目标检测的分析。
道德原则
Spherotech链霉亲和素珠表面设计为简单有效方法的基质，例如：
•用于分离生物素化化合物（如蛋白质、免疫球蛋白、糖、凝集素或DNA/RNA和microRNA）的蛋白质包覆珠
•磁性链霉亲和素包衣珠可用作免疫分析和基因组分析的基质
•荧光标记的链霉亲和素小颗粒可用作检测探针。

使用说明
Spherotech链霉亲和素颗粒的制备
使用前应清洗颗粒，以去除0.02%的NaN3
作为防腐剂添加的。通过使用
较大颗粒的离心。
1.轻轻摇动小瓶，以获得均匀的悬浮液。
2.向管中添加适量的颗粒（见下文“结合能力”一节）。
3.将试管置于1.5K的离心机中20分钟。
4.用移液管抽吸上清液。避免用移液管端接触颗粒颗粒。
5.添加推荐的缓冲区。使用与上述步骤2中相同的体积，然后轻轻地重新使用（不要使珠子产生漩涡）。
6.重复步骤3至5，最后一次清洗后，添加适当体积的推荐缓冲液，以获得适当的工作温度
颗粒浓度。

用于RNA操作的Spherotech链霉亲和素颗粒的制备。
注：Spherotech链霉亲和素不以无核糖核酸酶溶液提供。
1.向溶液a和溶液B中添加DEPC至0.1%（1ml/L）的最终浓度（见下文缓冲液和溶液部分）。
2.用力摇晃。
3.在室温下培养1小时，并对溶液进行高压灭菌。
4.用相同体积的溶液A冲洗颗粒两次，持续1-3分钟。
5.用相同体积的溶液B清洗颗粒一次。
6.将颗粒重新悬浮在溶液B中。
生物素化程序
生物素化核酸、蛋白质和肽很容易与Spherotech链霉亲和素磁性颗粒结合，用于分离实验。遵循
在结合过程中，由于Spherotech磁粉的*磁性，生物素化产物易于操作。这个
当粒子置于磁场中时，其磁性能简化实验过程中的操作，如更换缓冲液。
生物素/链霉亲和素连接系统（KD=10-15 M）的结合导致隔离的*非共价相互作用。
笔记：
•所有生物素试剂应包含一个间隔臂，长度至少为6个C原子，以减少空间位阻。
•样品中的游离生物素会降低Spherotech链霉亲和素颗粒的结合能力。一种可一次性使用的装有液体的柱
Sephadex®将从样品中去除未结合的生物素。
•生物素化寡核苷酸应通过反相高效液相色谱法纯化，以获得最佳结合效率。
•建议在寡核苷酸引物的5′端进行特异性生物素化，以保持3′端游离延伸。

寡核苷酸引物的生物素化。
a） 生物素化寡核苷酸可从寡核苷酸合成公司购买。
b） 合成反应中的生物素磷酰胺允许生物素在5'-端发生，对标记的寡核苷酸的特异性或熔化温度没有影响。
c） 通过化学掺入5'-或3'-氨基修饰的寡核苷酸进行生物素化，将导致生物素酯的所有伯胺基团
寡核苷酸。建议在DNA合成过程中直接将低聚物的5'端或3'端加入生物素。
2.生物素化引物的纯化。
a） 生物素化寡核苷酸最好通过反相HPLC从未结合的生物素中纯化，这一点非常重要，因为游离生物素
将占据珠子上的结合位点，并降低生物素化PCR产物的结合能力。这一净化步骤也确保了全长
标记水平接近100%的脱氧核苷酸。
b） 生物素化寡核苷酸的HPLC纯化是将全长生物素化寡核苷酸装载到链霉亲和素包衣珠上所必需的。
NAP柱纯化的寡核苷酸影响装载过程。
3.已合成寡核苷酸的生物素化。
Photobiotin®标记系统可将生物素引入已合成的低聚物中。生物素随机并入寡核苷酸中。
4.较大DNA的片段的生物素化。
a） 建议在使用生物素磷酰胺进行DNA合成期间，在低聚物的5'端直接加入生物素。a）使用带有生物素化引物的PCR进行末端标记。
b） 酶法结合生物素dUTP标签。生物素dUTP标签可通过使用Klenow DNA聚合酶、缺口翻译或混合引物标记的末端标记，以酶法并入双链DNA的片段。
c） 光生物素化。生物素的光活化形式可以在紫外光下随机并入DNA的片段。
5.使用可切割试剂进行生物素化。
a） 生物素dUTP类似物与可切割连接物的酶结合。生物素与含有二硫化物的连接臂的结合
该键允许DNA的片段的简单解离，因为二硫键很容易被二硫苏糖醇（DTT）切割。这种试剂
通过末端标记、缺口翻译或混合引物标记将酶结合到DNA的片段中。建议使用生物素-21 SS dUTP。
b） NHS生物素鸟苷类似物的化学掺入。亚氨基生物素的掺入允许结合核酸的解离
pH值发生简单变化的酸片段。链霉亲和素/亚胺生物素复合物在pH 4.0下解离。在pH值为9.5或更高时，亚胺生物素将与Spherotech链霉亲和素颗粒紧密结合。释放的亚胺生物素可重新固定在Spherotech链霉亲和素颗粒上。