Santa Cruz公司产品Protocols及相关支持产品

Santa Cruz生物技术公司为*抗体提供了高品质的支持产品。包括用于WB和IHC的自产的第二抗体， 用于IP研究的发光试剂，琼脂糖标记proteinA，proteinG PLUS和proteinL，用于WB的胞核提取，全细胞溶解物，组织提取试剂，WB膜，TransCruz凝胶迁移寡核苷酸，封闭物和实验室常用试剂。 提供用于WB的Cruz MarkerTM分子量标准和预染分子量标准。ImmunoCruz染色系统用于IHC（石蜡切片）染色，为预稀释，即用系统。还介绍一系列凋亡检测试剂 盒。支持产品主要涵盖以下方面：1）WB 2）IP 3）IP/WB 4）免疫复合蛋白激酶检测 5）免疫过氧化物酶细胞染色 6）免疫荧光细胞染色 7）流式细胞技术（FCM）8）ELISA检测 9）TransCruz凝胶超迁移实验 10）用多肽中和抗体活性的方法 11）染色质免疫沉淀（ChIP）实验 12）siRNA转染 13）半定量RT-PCR 14）溶液配制。

1. WB

A.样品准备
注意：细胞培养基产品包括经典和特殊培养基，血清，培养基添加物，诱导物，抗生素。产品列表请登陆www.scbt.com。

单层细胞

室温下，移去培养基并用PBS冲洗直径100mm的培养皿。以下步骤均在冰上或4℃操作，使用冰预冷的新鲜缓冲液。
加入0.6ml RIPA裂解液（sc-24948）。4℃轻轻晃动细胞培养皿15min。用细胞刮将贴壁细胞刮下。转移裂解液至微量离心管内。

用0.3ml RIPA裂解液洗一次培养皿，将洗液与之前的溶解物合并。（可选择：加入10μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）储存液和/或用21号注射器针头切割DNA）冰上孵育30-60min。
将细胞溶解物4℃离心，10000×g，10min。转移汉细胞裂解物的上清至新的离心管内，弃沉淀。

注意：涉及磷酸化作用研究时，可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒（sc-24964）富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

悬浮细胞
室温低速离心5min，收集约2.0×107个细胞。小心除去培养基。
室温下用PBS冲洗细胞沉淀，再次低速离心5min，小心除去培养基。
加入1.0ml冰预冷的RIPA裂解液（sc-24948），裂解液中现用现加入蛋白酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂。用移液器轻轻悬浮细胞，冰上孵育30min。
 用21号注射器针头、杜恩斯匀浆器或超声进一步破坏使细胞均质化。注意不要使裂解物温度过高。（可选择：加入10μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）储存液。）冰上孵育30min。
将裂解液转移至离心管，4℃离心，10000×g，10min。转移上清至新的离心管内，弃去沉淀。

注意：涉及磷酸化作用研究时，可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒（sc-24964）富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

组织样品
称重组织块，并用干净的剃刀剪碎。冰冻组织可被切的很薄，并在含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液（sc-24948）中解冻。3ml冰预冷的RIPA/g组织。
杜恩斯匀浆器或超声进一步破坏使细胞均质化，温度维持在4℃。（可选择：加入30μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）储存液/g组织。）冰上孵育30min。
将裂解液转移至离心管，4℃离心，10000×g，10min。弃沉淀。可加长离心时间获得更好的裂解产物。

注意：涉及磷酸化作用研究时，可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒（sc-24964）富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

B电泳

将样品（每个泳道全细胞提取物40-60μg，胞核提取物10-20μg或10-20ng纯化蛋白）与等体积2×电泳上样缓冲液（sc-24945）混合，煮沸2-3min。未用完的样品可保存在-20℃。
上样，10μl/1.0mm×0.75mm孔。
推荐使用Cruz MarkerTM分子量标准（sc-2035）。小胶（0.75mm）每孔上样2μl，大胶（1.5mm）每孔上样5μl。如用与Cruz MarkerTM一致的第二抗体，可看到用于检测试剂的内参条带。也可选择预染分子量标准（sc-2361）。
电泳步骤参考标准protocols。
根据厂家protocols，用电转装置将蛋白条带转移至NC膜或PVDF膜上。

注意：Cruz Blot SystemTM提供预制好的人或小鼠全细胞提取物和核提取物，或小鼠组织提取物。

C.Immunoblotting
用Blotto（BlottoA或B；用抗牛第二抗体时建议使用BSA）封闭膜上的非特异位点，室温孵育30-60min。也可选择用不含Tween-20的Blotto，在封闭容器内4℃过夜孵育。
如果使用的是磷酸化特异抗体，建议向封闭液和抗体稀释液中加入50 mM NaF（NaF：sc-24988）抑制磷酸化酶。
封闭好的膜与*抗体（Blotto稀释）稀释液室温孵育1小时。（如果是磷酸化特异抗体，要用加了50 mM NaF的Blotto稀释液。）抗体*浓度根据滴度决定。建议起始稀释度为0.5-2.0μg/ml。用TBST洗膜3次，5min/次。
将 膜与HRP或AP标记的第二抗体稀释液（Blotto稀释）室温孵育45min，稀释度1:500-1:2000。如果背景过高，第二抗体需进一步稀释 （可达1:20000）。作ECL时，如果使用Cruz MarkerTM分子量标准（sc-2035），必须使用Cruz MarkerTM compatible secondary antibody作为可视化标准。
TBST洗膜3次，5min/次，然后TBS洗膜一次，5min。
将膜与化学发光试剂（sc-2408）孵育。如果发光化合物用于可见光检测，必须用HRP标记的第二抗体。

2．IP

注意：本操作步骤可用于放射性或正磷酸盐标记的细胞。（放射性物质的使用及处理应遵循适当的条例如OSHA和 NRC指导手册。）细胞标记必须在无待标记氨基酸残基或无磷酸盐的培养基中进行。建议标记前使细胞处于适当的饥饿状态。孵育培养细胞（100mm细胞培养 皿上约80-90%
单层细胞汇合或培养瓶内含约2-5×107个悬浮细胞）。通常，用传代贴壁细胞或2-5×107个悬浮细胞可得到*标记。

例如：除去培养基，加入含5%透析胎牛血清和100μCi/ml35S-蛋氨酸的无蛋氨酸培养基。37℃孵育1h。某些蛋白需延长标记时间（18hrs）。有必要用PBS洗涤细胞除去未结合的放射物。

向单层传代细胞中加入1-3ml冰预冷的RIPA（sc-24948），4℃孵育10min。对于悬浮细胞则向离心管中加入RIPA洗涤细胞沉淀。
用21号注射器针头或超声波反复裂解细胞。转移裂解物至微量离心管中。
可选择：用1.0ml冰预冷的RIPA冲洗细胞培养皿，与之前的合并处理。
4℃，10000×g离心10min。冰上转移上清（细胞溶解液）至新的微量离心管。
预处理细胞溶解液，加入1.0μg的control IgG（与*抗体的种属来源一致）和20μl悬浮的（25%v/v）琼脂糖偶联物（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。4℃孵育30min。
2500rpm（约1000×g），4℃离心30s。
转移上清或约100-1000μg总细胞蛋白至微量离心管中。加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗体（抗体浓度应滴定测定），4℃孵育1-2hrs。或者，可加入20μl*抗体琼脂糖偶联物，混匀，4℃孵育1hr-过夜；跳过下一步骤。
加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好管子，4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm（约1000×g），4℃离心30s，收集免疫沉淀物，小心吸弃上清。
用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次，每次重复以上离心步骤。
zui后一次洗涤后，小心吸弃上清，用40μl 2×电泳上样缓冲液（sc-24945）重悬沉淀。
样品煮沸2-3min，上样电泳分离免疫复合物，通过放射自显影观察结果。未用完的样品可保存在-20℃。
可选择：煮沸后，样品可经离心沉淀琼脂糖颗粒，然后SDS-PAGE分析上清。

3．IP/WB

按照之前描述的WB程序准备总细胞溶解物。

注意：如进行磷酸化研究，溶解物可用Santa Cruz的PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒（sc-24964）富集磷酸化蛋白。 

预处理全细胞溶解物（可选择步骤），约1ml全细胞溶解物或组织提取物，加入0.25μg适当的control IgG（与*抗体种属来源一致）和20μl悬浮的（25%v/v）琼脂糖偶联物（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂 糖）。4℃孵育30min。
2500rpm（约1000×g），4℃离心30s。转移上清（细胞溶解物）至干净的微量离心管。
1ml细胞溶解物或约100-1000μg总细胞蛋白，加入10μl*抗体琼脂糖偶联物，混匀，4℃孵育1hr-过夜。
可 选择：如无*抗体琼脂糖偶联物，1ml细胞溶解物加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗体（抗体浓度应滴定测定），4℃孵育1-2hrs。加入 20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好管子，4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm（约1000×g），4℃离心30s，收集免疫沉淀物，小心吸弃上清。
用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次，每次重复以上离心步骤。
zui后一次洗涤后，小心吸弃上清，用40μl 2×电泳上样缓冲液（sc-24945）重悬沉淀。
样品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上样孔上样5-10μl。
电泳并按WB程序作免疫杂交。

注意：选择不同的第二抗体，55kDa重链和27kDa轻链IgG，可检测到*抗体。如果以上步骤中采用*抗体琼脂糖偶联物则*抗体条带不明显。

4．免疫复合蛋白激酶测定
从100mm细胞培养皿（单层细胞80-90%汇合）移除培养基，PBS洗一次。
加入1-3ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液（sc-24948），4℃孵育10min。（注意：RIPA裂解缓冲液对某些激酶效果不好。需要优化裂解液成分来保持激酶活性。）
用21号注射器针头反复抽吸使细胞破碎充分，转移至15ml离心管中。
用1ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液，0.5%Triton X-100（sc-29112）冲洗培养皿，与原裂解液合并。
10000×g，4℃离心10min。4℃转移上清至新的离心管内。
转移1.0ml细胞提取物（上清）至1.5ml离心管中。加入1-10μl（0.2-2μg）*抗体（抗体*浓度经滴定测定），4℃孵育1hr。
加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好盖子，4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm（约1000×g），4℃离心5min，收集免疫沉淀复合物。小心吸弃上清。
1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次，每次重复上述离心步骤。
 20μl 适当的蛋白激酶缓冲液重悬沉淀（如50mM HEPES（sc-29097），0.1mM EDTA（sc-29092），0.01%BRIJ 35（sc-29087）），0.1mg/ml BSA，0.1% β-巯基乙醇（sc-29086），0.15M NaCl（sc-29108）。缓冲液成分根据所研究的激酶调整。
加入10-1000ng多肽底物。该底物/酶/细胞系的多肽底物浓度应根据经验决定。
准备1ml ATP混合物：930μl适当的蛋白激酶缓冲液，6μl 50mM ATP，pH7.0，20μl 2.0 M MgCl2和44μl [γ32P]-ATP[10mCi/ml]。每个样品加入10μl ATP混合物，30℃孵育30min。冰上放置。
加 入等体积2×电泳上样缓冲液（sc-24945）终止反应，样品煮沸2-3min。样品可离心沉淀琼脂糖微珠（可选择）；分析上清。跑SDS-PAGE， 通过放射自显影观察结果。未用完的样品保存在-20℃。检测中如用小肽底物，样品必须通过闪烁计数或其他标准方法而不是SDS-PAGE来分析。

5．免疫过氧化物酶细胞染色

A． 组织培养细胞

在无菌的盖玻片上培养细胞37℃过夜。PBS简单冲洗后按以下程序之一固定细胞：
1）-10℃甲醇溶液5min，自然干燥（推荐方法）；或
2）冰丙酮2min，自然干燥；或
3）1%甲醛-PBS 10min（保持湿润）。
PBS洗三次。
可选择：含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min，淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

B．冰冻组织切片

冰冻组织存放于液氮中。切片前（2周）可保存于-70℃。
95%乙醇清洁玻片，涂一薄层黏附剂，自然晾干。或使用预处理的玻片。
切片厚度4-10μm。室温贴片。切片保存在-70℃。固定染色前室温解冻切片。

注意：免疫组化切片固定剂清单包括Clarion和Crystal固定剂。

冰丙酮固定切片10min，冷藏。PBS洗三次。
可选择：含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min，淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。
注意：组织内有丰富的生物素（引起高背景染色），建议甲醛固定，遵循石蜡包埋组织切片protocol，因为石蜡包埋组织中内源性生物素被破坏。

C． 甲醛固定，石蜡包埋组织切片

按标准程序甲醛固定，石蜡包埋组织。
95%乙醇清洁玻片，涂一薄层黏附剂，自然晾干。或使用预处理的玻片。
切片厚度4-6μm。二甲苯脱蜡，3次，5min/次。依次过梯度酒精水化：100%乙醇，2次，10min/次，95%乙醇，2次，10min/次。去离子水浸洗1min。甩去切片上多余的液体。

可选择：可做抗原修复。甲醛固定和石蜡包埋导致某些抗原决定簇被封闭，可按以下方法修复暴露抗原位点：

i. 热修复（推荐方法）：切片浸没入10mM柠檬酸钠缓冲液（sc-29109），pH6.0；或浸没入含0.01% （w/v）EDTA（sc-29092）的50mM甘氨酸-HCl缓冲液（甘氨酸：sc-29096）中，pH3.5。95℃加热5min。换新的缓冲 液，95℃加热5min。（不同组织类型*孵育时间不同）。将切片放入缓冲液中冷却约20min。用去离子水洗3次，2min/次。甩干切片。
ii. 胃蛋白酶：切片用含0.1%胃蛋白酶的0.01N HCl室温孵育10-20min。去离子水冲洗几次，甩去多余液体。
iii. 皂角苷：切片用含0.05%皂角苷的去离子水室温孵育30min。PBS至少洗3次，甩去多余液体。

可选择：切片在含0.1-1%过氧化氢的去离子水中孵育5-10min，淬灭内源过氧化物酶活性，PBS洗2次，5min/次。

注意：组织内有丰富的生物素（引起高背景染色），建议甲醛固定，遵循石蜡包埋组织切片protocol，因为石蜡包埋组织中内源性生物素被破坏。

D．免疫过氧化物酶染色

切片的免疫酶染色，建议用Santa Cruz的ABC染色试剂盒或ImmunoCruzTM染色试剂盒。ABC染色试剂盒利用亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物作为检测物；而 ImmunoCruzTM染色试剂盒利用链亲和素辣根过氧化物酶复合物作为检测物，该体系包括所有预稀释好的第二抗体，即用型，也包括预稀释的*抗体。 所有染色体系中均有完整的protocol；以下为简化版protocol。
所有反应步骤均于室温下湿盒内完成。使用前试剂盒试剂要先恢复至室温。操作中切片不能过干。每步操作完用吸引管吸除试剂，避免切片过干。要用足够的反应液覆盖标本（通常100μl/张切片就足够了）。

ABC染色试剂盒

PBS稀释的1.5%封闭血清孵育1hr。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。
滴加*抗体室温孵育30min或4℃过夜孵育。抗体*反应浓度需经滴定确定；建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次，5min/次。
滴加预稀释的生物素化第二抗体或用含1.5%封闭血清的PBS稀释至1μg/ml的生物素化第二抗体，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。
滴加亲和素生物素酶反应物，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。
用提供的过氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出现理想染色止。注意监控单张切片的恰当显色时间。去离子水洗5min。可用苏木素（sc-24973）复染5-10s。迅速用去离子水洗几次。
梯 度酒精，二甲苯依次脱水：浸没入95%乙醇2次，10s/次，然后100%乙醇2次，10s/次，zui后二甲苯3次，10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加 1-2滴封片固定剂（如Clarion，sc-24942），盖上盖玻片（sc-24975），光学显微镜下观察。

ImmunoCruzTM染色试剂盒

滴加1-3滴血清封闭液孵育20min。甩去封闭液。
迅速加入1-3滴预稀释的*抗体。如果所用染色系统不含预稀释的抗体，就把*抗体用血清封闭液稀释至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS冲洗，然后切片浸没入PBS内洗2次，2min/次。甩去多余的液体。
滴加1-3滴生物素化第二抗体，孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP-链亲和素复合物，孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP底物混合物。显色30s-10min，或直至出现理想染色止。去离子水冲洗，然后切片浸没入去离子水内洗2次，2min/次。
复染，脱水，封片。（同ABC染色试剂盒）

6．免疫荧光细胞染色

切片准备同免疫酶染色，省去包括过氧化氢处理细胞在内的zui后一步。
每步操作完吸除反应液，但要避免样品过干。用足够的反应液覆盖样品（100-500μl/张切片）。
滴加含10%封闭血清-PBS，孵育20min，减少和IgG结合的非特异位点。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。
滴加*抗体，孵育60min。抗体*反应浓度应滴定决定；建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml，PBS洗3次，5min/次。
滴加生物素标记或荧光染料标记的第二抗体（用含1.5%-3%封闭血清的PBS稀释至1-5μg/ml），孵育45min。PBS洗3次。如果使用荧光染料标记的第二抗体，须暗室孵育，并省略下步。
滴加链亲和素-荧光素，暗室孵育15min。链亲和素标记物浓度需经滴定决定；建议PBS稀释至10-20μg/ml。PBS充分洗净。
用水相固定剂或90%甘油PBS溶液封片。
选择适当的滤镜在荧光显微镜下观察。室温避光保存切片（UltraCruzTM固片剂：sc-24941）或保存在4℃（甘油/PBS固片剂）。

7．流式细胞仪技术

细胞表面染色

准备细胞
1） 溶解血红细胞。（注意：准备足够的细胞用于10份样品100μl/份检测）。
1ml全血加入14ml恢复至室温的1×FCM溶解液（sc-3621）中。
轻轻混匀，室温孵育3-5min。不要超过5min。
离心5min，弃上清，预冷的5ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。
离心5min，弃上清，预冷的1ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。
2）准备培养细胞。（注意：本protocol通常处理50ml培养细胞。单层细胞，切勿胰酶消化！用0.2%EDTA/PBS溶液代替。1×PBS洗细胞1次。）
血球计数仪计数细胞。
1000rpm离心5min，弃上清，用足够的1×PBS轻轻重悬沉淀至终浓度为1×107细胞/ml。

各管加入荧光染料标记的*抗体或isotype control。（20μl/106细胞。滴定抗体确定*浓度）。
每管加入100μl RBC溶解的全血或单细胞悬液。混匀，放在有盖的冰盒内孵育15-30min。
每管加入1.5ml FCM冲洗缓冲液（sc-3624），颠倒混匀。1000rpm离心5min，弃上清，500μl 1%多聚甲醛重悬沉淀。
测读分析数据。

细胞内染色

可用适当的活性物质刺激细胞。确保有未刺激细胞对照。
50ml离心管收集细胞。2000rpm离心5min，弃上清。
室温1×PBS 20ml重悬细胞。
细胞计数。
2000rpm离心5min除去PBS。4℃1×PBS洗1次。2000rpm离心5min除去PBS。
每106个细胞加入1ml 4℃ FCM固定缓冲液（sc-3622），冰育15-30min。
4℃1×PBS洗细胞2次，离心，弃上清。
每106个细胞加入1ml -20℃ FCM渗透缓冲液（sc-3623），逐滴加入混悬。冰育15min。
离心；4℃ FCM冲洗缓冲液（sc-3624）。
2000rpm离心5min，弃上清。每107个细胞加入1ml FCM冲洗缓冲液，然后等分细胞（106）至各待测管中。
细胞内着染：各管加入荧光染料标记的*抗体或isotype control。室温避光孵育1hr。

注意：为得到*结果应滴定荧光染料标记抗体。

1ml FCM冲洗缓冲液洗细胞2次， 500μl新鲜FCM冲洗缓冲液重悬。
24hrs内检测分析。

8．ELISA检测

包被微孔板，靶蛋白用50mM碳酸盐包被液（pH9.0）稀释。*包被浓度须经滴定，但纯化抗原通常为1μg/ml，50μl/孔。封好，4℃过夜孵育。
弃净液体。加入200μl/孔封闭液（含1%BSA和0.02%叠氮钠的PBS）封闭非特异结合位点。室温孵育1-2hrs或4℃过夜孵育。
弃净液体。含0.02%叠氮钠的PBS洗1次。湿润的微孔条可用塑料密封袋密封，4℃保存4周。用前，弃净多余的液体。
加入50μl/孔封闭液稀释的待测样品和对照。抗体需梯度稀释测定滴度或用以前的工作浓度作筛选或半定量。室温孵育1hr。
含0.05%Tween-20（sc-29113）的PBS洗板3次，弃净液体。
加入50μl/孔封闭液稀释的1:100-1:1000的碱性磷酸酶标记抗体。*抗体浓度需滴定决定。室温孵育1hr。
弃净液体。含0.05%Tween-20的PBS洗板3次，拍干，弃净液体。
乙醇胺缓冲液（10mM乙醇胺，0.5mM MgCl2（sc-29098），pH9.5）洗1次，弃净液体。
用乙醇胺缓冲液稀释底物（PNPP，sc-3720）至终浓度1mg/ml。加入50μl/孔。反应10-20min直到阳性对照OD405/490读数达1.0。加入50μl/孔0.1M EDTA，pH7.5终止反应。OD405/490读数。

9、TRANSCRUZTM 超凝胶迁移检测

用多聚核苷酸激酶将[γ32p]-ATP 标记到寡核苷酸上，达到50,000cpm/ng
准备胶迁移缓冲液：10mMTris,Ph7.5, 50mMNaCL,1mMDTT,1mM EDTA,5%甘油
准备20ul的反应混合物，将3-10ug核抽提物，和1ug多聚dIdC溶解在20ul胶转移缓冲液中。加0.5ng标记的寡核苷酸探针，室温孵育20分钟。这组成了检测DNA-蛋白复合物的对照样品
为了检测抗体迁移或封闭DNA-蛋白复合物，按步骤3准备反应混合物，每20ul反应体积加1-2ul TransCruzTM 超凝胶迁移抗体。一般是在加了探针之后，才加抗体，但在加探针前加入抗体，可使结果加强
通过4% 聚丙烯酰胺凝胶电泳（25-30ma）,分开DNA和蛋白复合物。凝胶中含50mMTris,Ph7.5, 2mM EDTA,0.38M甘油.待胶干后，自动放射显影查看结果

10、肽的中和

对所有的santa cruz的亲和纯化的兔或山羊的多抗和单抗，都有相应的封闭肽做对照。通过将抗体和封闭肽的预先孵育，抗体对抗原的结合可以被阻止。
决定zui高的抗体稀释度，在这个稀释度下，可以一直获得理想的阳性结果。例如，H-Ras在免疫沉淀时，推荐的浓度是1ug/ml,但阳性结果是在50ng/ml。
封闭/竞争时，将抗体（抗体浓度按照以前提到的方法确定）和5倍重量的封闭肽混合在500ul的PBS中，室温孵育2小时，或4度过夜。
封闭/竞争后，用封闭缓冲液稀释抗体/封闭肽混合物，然后，按照所期望的实验的操作进行。

11，染色质免疫沉淀

注意：CHIP的实验步骤可以有很多不同版本，下面介绍的步骤适合大多数的实验
常温下，用PBS洗细胞，重悬细胞，使细胞数大约5*105个/ml（总细胞数2*107）。,
加甲醛，使终浓度为1%，室温孵育10分钟。
加甘氨酸至终浓度0.125M，终止交联反应
2000rpm,5分钟，离心细胞。用冷的PBS洗细胞一次
用6ml的裂解缓冲液重悬细胞，轻柔混合，2000rpm离心5分钟，收集粗提的核提取物。
再用PBS洗沉淀，沉淀可以冻存，或继续以下步骤。
用1.9ml的高盐裂解缓冲液重悬沉淀，转移到2ml的离心管中准备超声
超声条件需要优化，下面介绍的条件是在使用Sonics VC130和3mm的探头的基础上建立起来的：
在冰上操作，输出功率设置5（R）6,每隔30秒超声一次，共4次。
4°C，10，000rpm 离心15分钟，保存上清，确定上清中蛋白的浓度。
如果免疫沉淀，我们推荐100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz试剂（0.2—2ug）
注意：研究者可能希望使用连接有葡聚糖或磁珠的一抗，以便于选择后续免疫沉淀的试剂。有些情况下，将针对同一种蛋白不同表位的抗体联合使用会更好。
向染色质溶液加50ul Protein A/G-琼脂糖，4度，孵育30分钟，使其澄清，zui大速度，4度离心5分钟。
向上清中加一抗，4度孵育过夜。
加50ul Protein A/G –琼脂糖，4度孵育2小时。
12，000rpm离心20秒收获磁珠，并将管放在冰上
用1ml裂解缓冲液洗磁珠2次
用冲洗缓冲液洗磁珠四次
重悬磁珠在400ul洗脱缓冲液中
通过在67度水浴中孵育管子2小时以上，使反向交叉连接
离心去除磁珠，继续在67度水浴孵育上清过夜 Remove
10,000rpm离心3分钟去除残留的珠子，保留上清
分离DNA,用500ul 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提上清,剧烈振荡，14,000rpm离心3分钟分离两相。
保留水相，用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 （TE）  反向抽提有机相一次，在汇集水相
用600ul 氯仿/异戊醇抽提汇集的水相
DNA可以用商业化的试剂盒浓缩。

12. siRNA小干扰RNA

转染
*天：准备细胞
健康的细胞是成功转染的要求，在转染前明确细胞的生存状态
对于贴壁细胞：
1，吸弃培养基，用胰蛋白酶、EDTA、或其他合适的方法分散细胞，在胰蛋白酶化前，用无菌的1X PBS漂洗细胞2次。
2，一旦细胞分散，用4倍体积的含10% 胎牛血清不含抗生素的生长培养基（如DEME,RMPI1640）稀释悬浮液 。
（注意：这个阶段使用不含抗生素的培养基是转染成功的关键）
3，1,000 rpm离心5分钟，去除培养基，用不含抗生素的培养基重悬沉淀
4，转移细胞到12孔的细胞培养板 以便细胞过夜培养后，细胞覆盖率达60-80%
（注意：细胞覆盖率也是成功转染的关键）
对于悬浮细胞：
1，1,000 rpm离心5分钟
2，去除培养基，用不含抗生素的含10% 胎牛血清的培养基重悬沉淀
3，转移细胞到12孔的细胞培养板或转到多聚赖氨酸包被的8孔板中，以便细胞过夜培养后，细胞覆盖率达60-80%
（注意：多聚赖氨酸包被是使悬浮细胞黏附到板底必须的）
第二天
 准备转染试剂和转染
 注意：对于不同的实验目的有不同的操作步骤，请根据试验需要选择下面介绍的操作步骤。
对于蛋白和转录检测
注意：当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时，转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。
1，对每一次转染，在一个无菌的小管里准备下面的混合物 这一步无关细胞培养类型
 （A） 加3.6ul 10uM的siRNA到40ul siRNA转染培养基中，轻柔混合，在室温中放置15分钟 （注意：如果需要低浓度的siRNA，用siRNA稀释缓冲液进行稀释）
（B）加2.4ul siRNA转染试剂到40ul的siRNA转染培养基中，轻柔混合，室温放置5分钟。
注意：虽然siRNA转染试剂对许多细胞都有很高的转染效率，但并不是适用于所有的细胞
 2， 5分钟后，混合A和B形成siRNA-siRNA转染试剂混合物，轻柔混合，室温孵育20分钟。
 3， 然后，向每个含有siRNA-siRNA转染试剂混合物的管中加入0.32ml的siRNA转染培养基，轻柔混合
对贴壁细胞：
    4.1转染前，吸弃培养基，用1ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次，弃培养基。
4.2在洗过的细胞上，铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物，37度，5-7小时
4.3孵育后，向含有转染细胞的每个孔中加0.4ml 生长培养基，其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍，无需去除转染混合物。如果，毒性是个问题的话，去除转染混合物，以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时
4.4孵育结束后，用新鲜正常生长培养基替换，继续孵育24-72小时
4.5从细胞中吸弃培养基，用1ml 1*PBS洗细胞一次，然后丢弃
4.6放置在冰上，向孔中加入300ul 1*电泳缓冲液，用移液器吹打，混匀。（注意：混合物可能变得粘稠）
如果进行Western blot的话，转移混合物到15ml的锥形管中，放在冰上，对混合物进行超声波降解，每15秒一次，用输出功率的40%。如果，超声后，起很多泡泡，1000转/秒，离心3分钟，然后，按照western blot的方法进行电泳，免疫印迹。
如果做转录分析，按照我们的半定量RT-PCR的操作进行。
对悬浮细胞
4.1在转染前，1000转/秒， 离心5分钟收集细胞。去除培养基，用1ml 无菌的siRNA转染培养基 。
4.2 再次离心1000转/秒，5分钟，去除培养基。用稀释的siRNA-siRNA转染试剂复合物重悬细胞。转移细胞到12孔组织培养板，37°C孵育5-7小时，每次单独转染时重复。
4.3孵育后，加0.4ml含2倍正常血清和抗生物浓度的生长培养基到每个含被转染细胞的孔中，不要去除转染混合物。如果有毒性的话，去除转染混合物，代替以正常生长培养基，在额外孵育18-24小时。
4.4一旦孵育结束，离心细胞，去除培养基。用新鲜的正常生长培养基重悬细胞。转移细胞到12孔组织培养板，继续孵育24-72小时。
如果  需要做western blot分析，则继续以下步骤
转 移混合物到15ml的锥形管中。将2*电泳上样缓冲液用Milli-Q超纯水稀释到1* 。1000转离心5分钟，收集细胞，去除培养基，用1ml PBS洗细胞，重复一次，用300ul 1*电泳上样缓冲液重悬细胞，放在冰上，对混合物进行超声波降解，每15秒一次，用输出功率的40%。如果，超声后，起很多泡泡，1000转/秒，离心3 分钟，然后，按照western blot的方法进行电泳，免疫印迹。
如果需要转录分析，参照半定量RT-PCR步骤。

免疫荧光检测
注意：当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时，转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。
1，准备以下混合物：
（A）加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA转染培养基中，轻柔混合，在室温放置5分钟  注意：如果需要低浓度的siRNA，用siRNA稀释缓冲液稀释
（B） 加1.2ul siRNA转染试剂到20ul siRNA转染培养基中，轻柔混合，室温放置5分钟。注意：虽然，对多种的细胞系有很高的转染效率，但siRAN转染试剂并不是对所有细胞都适合。
2，5分钟后，混合A和B，形成siRNA-siRNA转染试剂复合物，轻柔混合，室温孵育20分钟。
3，孵育后，加160ul siRNA转染培养基到每个含有siRNA-siRNA转染试剂复合物的管中，轻柔混合
  从这一步起，对悬浮细胞和贴壁细胞的处理方法相同
4，转染前，吸弃培养基，用0.3ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次，去除培养基。
5，在洗过的细胞上，铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物，37度，5-7小时
6，孵育后，向含有转染细胞的每个孔中加200ul 生长培养基，其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍，无需去除转染混合物。如果，毒性是个问题的话，去除转染混合物，以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时
7,孵育结束后，用新鲜正常生长培养基替换，继续孵育24-72小时
8,使用恰当的操作步骤检测细胞，参见免疫荧光染色步骤

13，半定量RT-PCR

cDNA合成
准备试剂：1ul oligo（dT） 12-18（500 µg/ml）
1 ng-5 µg 总 RNA
1 µl 10 mM dNTPs
用不含RNA酶的去离子水补加到总体积12 µl
70℃ 孵育 5 分钟，迅速放在冰上，再加入
4 µl 5x反转录酶缓冲液
2 µl 0.1 M DTT
1 µl RNase 抑制剂
42℃孵育 2 分钟。
加1 µl 反转录酶（200 units）
  42℃ 孵育 50 分钟，然后，
在70℃孵育15 分钟 终止反应
注意：作为优化的步骤，加1 µl RNase H （2 unit/µl）
37℃ 孵育20分钟

*轮PCR 反应：
准备以下试剂
5 µl 10x PCR 缓冲液（含或不含MgCl2）
*5 µl 25 mM MgCl2 （调整不同的MgCl2浓度,推荐终浓度 2.5 mM）
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物对 A
1 µl Taq DNA 聚合酶
2 µl cDNA 加水使体积达到50 µl
 94℃孵育 2 分钟，变性 cDNA.
进行的15–40 个循环的 PCR.退火和延伸反应是根据引物和模板情况依经验而确定的。

第二轮 PCR 反应
准备以下试剂
5 µl 10x PCR 缓冲液（含或不含MgCl2）
*5 µl 25 mM MgCl2 （调整不同的MgCl2浓度,推荐终浓度 2.5 mM）
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物对 B
1 µl Taq DNA 聚合酶
1–5 µl *次PCR 产物，并补加水到50 µl
94℃孵育 2 分钟变性 cDNA.
进行的15–40 个循环的 PCR.退火和延伸反应是根据引物和模板情况依经验而确定的。
PCR产物在琼脂糖凝胶中，EB染色后可见。